關(guān)于炎癥因子Il-6和血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)內(nèi)皮脂酶表達的信號傳導(dǎo)通路的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 目前臨床上在脂質(zhì)代謝紊亂方面的治療還主要集中在降低血漿低密度脂蛋白膽固醇(low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C)水平方面。降低LDL-C水平減少罹患心血管疾病風(fēng)險的觀點已經(jīng)得到廣泛認同。然而臨床結(jié)果顯示經(jīng)過他汀類藥物標(biāo)準(zhǔn)治療后即使LDL-C達標(biāo)，仍有10.9％的心血管剩留風(fēng)險。治療新靶點研究(TNT)顯示，經(jīng)過他汀類藥物強化治療后即使LDL-C水平降至1.99mmol

2、/L，明顯低于達標(biāo)水平，仍有8.7％的絕對冠狀動脈事件剩留風(fēng)險，提示即使經(jīng)過他汀類藥物強化治療，冠狀動脈事件剩留風(fēng)險仍較高。血脂異常相關(guān)的心血管剩留風(fēng)險與多種因素有關(guān)，以低高密度脂蛋白(high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C)為特征的血脂異常是經(jīng)過他汀類藥物治療降低LDL-C水平后最常見的其中一種。如何降低冠狀動脈事件剩留風(fēng)險，減少心血管事件發(fā)生率，也是目前研究的焦點之一。HDL-C水平與心血管

3、發(fā)生率呈負相關(guān)，約有1/3的血脂異?；颊咄ㄟ^提高HDL-C水平而受益[1]，有研究表明血漿HDL-C每升高0.03mmol/L(1.0mg/dl)就可以使罹忠心血管疾病的風(fēng)險下降2％-4％[2]。另外LDL-C/HDL-C比值也是一個與心血管事件密切相關(guān)而獨立于LDL-C和HDL-C的重要指標(biāo)[3-6]。因此治療動脈粥樣硬化除了在一定范圍內(nèi)降低LDL-C水平之外如何有效的提高HDL-C水平就成為了重要的研究方向。
　　 內(nèi)皮脂酶

4、(endotheliallipase，EL)是近年新發(fā)現(xiàn)的甘油三酯脂肪酶家族新成員，直接由血管內(nèi)皮細胞分泌，在局部發(fā)揮作用。主要具有磷脂酶活性，是代謝HDL-C的關(guān)鍵酶，如何能夠通過減低或抑制EL活性，從而減少HDL-C的降解，是治療動脈粥樣硬化的新發(fā)展思路。因此研究EL的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)節(jié)，如何有效的降低EL就顯得極為迫切。
　　 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6

5、，IL-6）是兩種非常重要的致動脈粥樣硬化危險因素。AngⅡ能通過增加巨噬細胞清道夫受體CD36，促進巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL)，加速泡沫細胞形成;能通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細胞凋亡、產(chǎn)生氧自由基和影響纖溶功能等多方面參與動脈粥樣硬化的病理過程;可以增加斑塊不穩(wěn)定因子[7]EMMPRIN和MMPs[8、9]的表達，加重動脈粥樣硬化病變。IL-6也是一種重要的致動脈粥

6、樣硬化炎癥因子，它構(gòu)成了許多急慢性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，能夠損傷內(nèi)皮細胞造成內(nèi)皮細胞功能障礙，增加單核-內(nèi)皮細胞的粘附，還可以促進巨噬細胞對脂質(zhì)的攝取。核因子NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活后可啟動包括細胞因子、化學(xué)因子等多種效應(yīng)基因的表達。絲裂原活化蛋白激酶MAPKs級聯(lián)反應(yīng)是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與多種胞內(nèi)信息傳遞過程，能對廣泛的細胞外刺激發(fā)生反應(yīng)，研究表明，NF-κB和p38MAPK在動脈粥樣硬化中表達增加[10-

7、11]，可能是各種危險因子誘發(fā)動脈粥樣硬化的機制之一，NF-κB和p38MAPK信號傳導(dǎo)途徑可能在EL的轉(zhuǎn)錄表達過程中發(fā)揮作用。本課題通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，以IL-6和AngⅡ刺激內(nèi)皮細胞，觀察IL-6、AngⅡ、NF-κBp65阻斷劑PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamicacid)和SB203580（p38MAPK抑制劑）對EL表達的影響，驗證IL-6和AngⅡ是否通過NF-κB和MAPK信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)

8、EL的表達。
　　 研究方法：
　　 1.提取新生兒臍靜脈內(nèi)皮細胞進行原代培養(yǎng)，經(jīng)鑒定為內(nèi)皮細胞后，貼壁法傳代培養(yǎng)。第四代細胞用于實驗。
　　 2.用于實驗的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)共分六組:①AngⅡ刺激組:在培養(yǎng)液中加入AngⅡ，使之終濃度為10umol/L;②四氫化吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)+AngⅡ刺激組，在培養(yǎng)液中加入

9、PDTC使之終濃度為10mmol/L，預(yù)處理1h后加入AngⅡ(10umol/L)刺激;③SB203580+AngⅡ(10umol/L)刺激組，在培養(yǎng)液中加入SB203580使之終濃度為10umol/L，預(yù)處理1h后加入AngⅡ(10umol/L)刺激;④IL-6刺激組:在培養(yǎng)液中加入rhIL-6，使之終濃度為10ng/mL，預(yù)處理1h后加入AngⅡ(10umol/L)刺激;⑤四氫化吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)+IL-6刺激組，在

10、培養(yǎng)液中加入PDTC，使之終濃度為10mmol/L，預(yù)處理1h后加入rhIL-6(10ng/ml)刺激;⑥SB203580(10umol/L)+IL-6刺激組，在培養(yǎng)液中加入SB203580使之終濃度為10umol/L，預(yù)處理1h后加入IL-6(10ng/mL)刺激。各組分別孵育0、2、4、8、12、24h后終止實驗，收集細胞。
　　 3.將收集的細胞提取蛋白，使用westernblot法檢測EL的表達。
　　 4.以上

11、數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計學(xué)進行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.AngⅡ可以上調(diào)HUVECsEL的表達。HUVECs經(jīng)AngⅡ刺激后，在4，8，12h時其EL的表達量分別為0.362±0.041，0.738±0.034和0.387±0.051，均較0h(0.254±0.027)時明顯增加，均p＜0.05。
　　 2.PDTC可以抑制由AngⅡ引起的EL表達的增高。HUVECs經(jīng)PDTC預(yù)處理1h后再加入AngⅡ刺激，其EL表達

12、量在作用4，8，12h時分別為0.287±0.037，0.433±0.041，0.303±0.025，與AngⅡ刺激組在相應(yīng)時間段內(nèi)EL的表達量相比明顯降低，均p＜0.05。
　　 3.SB203580可以抑制由AngⅡ引起的EL表達的增高。HUVECs經(jīng)SB203580預(yù)處理1h后再加入AngⅡ刺激，其EL表達量在作用4，8，12h時分別為0.258±0.027，0.372±0.038，0.296±0.034，與AngⅡ刺激組

13、在相應(yīng)時間段內(nèi)EL的表達量相比明顯降低，均p＜0.05。
　　 4.IL-6可以上調(diào)HUVECsEL的表達。HUVECs經(jīng)IL-6刺激后，在4，8，12h時其EL的表達量分別為0.293±0.062，0.633±0.052，0.462±0.065，均較0h(0.254±0.027)時明顯增加，均p＜0.05。
　　 5.PDTC可以抑制由IL-6引起的EL表達的增高。HUVECs經(jīng)PDTC預(yù)處理1h后再加入AngⅡ刺激，

14、其EL表達量在作用4，8，12h時分別為0.208±0.056，0.582±0.036，0.428±0.066，與IL-6刺激組在相應(yīng)時間段內(nèi)的EL表達量相比明顯降低，均p＜0.05。
　　 6.SB203580可以抑制由IL-6引起的EL表達的增高。HUVECs經(jīng)SB203580預(yù)處理1h后再加入AngⅡ刺激，其EL表達量在作用4，8，12，24h時分別為0.238±0.023，0.508±0.058，0.423±0.052，