豬傳染性胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的制備及純化工藝研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉都是由病毒引起豬的消化道傳染病，密切接觸后感染性較強(qiáng)。該病臨床癥狀有嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水等，以引發(fā)初生仔豬高死亡率為特征。據(jù)獸醫(yī)防疫部門統(tǒng)計(jì)，這兩種疾病在豬的各種傳染病中，尤其是低齡仔豬中發(fā)病率、死亡率均較高，為影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病之一。目前針對這兩種疾病還沒有有效的治療藥物，本試驗(yàn)旨在開發(fā)防治TGE和PED的卵黃抗體，研究該卵黃抗體提取純化工藝，期望為這兩種疾病的防治和該卵黃抗體的規(guī)?；a(chǎn)提供理

2、論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　本試驗(yàn)為制備豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體所用的免疫原為豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒二聯(lián)滅活疫苗。免疫方案中設(shè)定兩個(gè)劑量不同的試驗(yàn)組和一個(gè)對照組，按照一定的程序免疫雞群，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗TGE和PED的卵黃抗體。采用豬傳染性胃腸炎病毒ELISA試劑盒和豬流行性腹瀉病毒IgY抗體PPA-ELISA檢測試劑盒，檢測雞群血清抗體和卵黃抗體效價(jià)變化趨勢;建立并檢測PED和TGE抗體共同作用的間接EL

3、ISA方法，建立的方法中采用上述疫苗為包被原，兔抗雞-HPR為酶標(biāo)二抗，經(jīng)方陣滴定法確定包被原和二抗的最佳工作濃度;卵黃抗體的提取工藝的研究中，采用水稀釋辛酸法、超濾法、硫酸銨鹽析法的聯(lián)合方法作為規(guī)模化提取純化卵黃抗體的工藝，并確定聯(lián)合法的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)中采用TGE和PED二聯(lián)滅活疫苗為免疫原，免疫蛋雞，收集高免蛋并處理，結(jié)果獲得了卵黃抗體濃度、卵黃抗體效價(jià)變化趨勢、血清抗體效價(jià)的變化趨勢以及兩種抗體共同作

4、用的效價(jià)變化趨勢。卵黃抗體在首免后一周內(nèi)逐漸產(chǎn)生，抗體效價(jià)波動性小，兩種病毒卵黃抗體效價(jià)（OD450值）最高達(dá)2.900左右，強(qiáng)化免疫后高效價(jià)卵黃抗體可維持4周以上;卵黃抗體濃度變化幅度小，整個(gè)檢測過程中生產(chǎn)的卵黃抗體濃度最高時(shí)可達(dá)9.50 mg/mL;血清中兩種抗體共同作用效價(jià)最高達(dá)到5500。設(shè)定的兩個(gè)劑量試驗(yàn)組中，血清中抗體和卵黃抗體在兩組中均不存在顯著性差異(P＞0.05)，各試驗(yàn)組和對照組差異極顯著(P＜0.01);確定的免疫

5、程序?yàn)?，胸部肌?nèi)注射免疫原，基礎(chǔ)免疫劑量為1.0mL，隨后每間隔兩周進(jìn)行一次常規(guī)免疫，劑量分別為1.0mL，第二次和第三次常規(guī)免疫劑量均為1.5mL，四周后進(jìn)行強(qiáng)化免疫，劑量為1.0mL，對照組同期均注射同等劑量生理鹽水。建立檢測TGE和PED抗體共同作用的間接ELISA方法，確定包被原、酶標(biāo)二抗最佳工作濃度分別為400倍和7000倍稀釋，通過敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)確定建立的間接ELISA方法具有可行性。
　　試驗(yàn)中確定的水稀

6、釋辛酸法、超濾法、硫酸銨鹽析法聯(lián)合提取卵黃抗體的各參數(shù)條件和過程為:一份卵黃液中加入9倍4℃蒸餾水、1％辛酸后充分?jǐn)嚢杈鶆虿⒂?℃靜置12h，4℃、12000rpm離心25min，獲得的上清液調(diào)節(jié)pH為7.5，溫度為25℃，采用50kDa膜包，在0.025MPa壓力下進(jìn)行超濾，獲得濃縮液再調(diào)節(jié)pH為7.0，加入等體積PBS緩沖液后，分別加入50％、33％的飽和硫酸銨進(jìn)一步的純化，獲得的提取液用PBS進(jìn)行稀釋即為高純度的卵黃提取物。由紫外