人、牛環(huán)孢子蟲病流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)研究.pdf

1、環(huán)孢子蟲（Cyclospora cayetanensis）是一種新現(xiàn)的腸道原蟲，感染主要集中在旅游者、艾滋病人和呈地方性流行地區(qū)的居民，寄生于人腸道上皮細(xì)胞內(nèi)，可引起人腹瀉、腸痙攣、食欲減退等癥狀。1995年之前僅有散在環(huán)孢子蟲感染的報(bào)道，1996至1997年間，北美地區(qū)有大規(guī)模的環(huán)孢子蟲病暴發(fā)，共有2944個(gè)環(huán)孢子蟲感染病例。自2000年以來，在美國、加拿大、英國、土耳其、哥倫比亞、南非等地區(qū)相繼暴發(fā)，特別是2013年7月以來發(fā)生在美

2、國的超過25個(gè)州的631個(gè)環(huán)孢子蟲確診病例，至少有49例由于嚴(yán)重腹瀉危及生命而住院。我國于1995年首次報(bào)道環(huán)孢子蟲感染病例，隨后在云南、安徽、浙江等地均有環(huán)孢子蟲感染病例報(bào)道。環(huán)孢子蟲病的暴發(fā)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至危及生命，無論是發(fā)展中國家還是歐美發(fā)達(dá)國家，其流行越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。
　　為了解非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腸道寄生蟲的感染情況，本試驗(yàn)采用盧戈氏碘液染色法和飽和蔗糖漂浮法對(duì)收集的3234份糞便樣品進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查

3、。結(jié)果有1748份檢查到腸道寄生蟲，總體感染率為54.05％。共檢查到11種腸道寄生蟲，其中感染率最高的為阿米巴原蟲，其次為鞭蟲和圓線蟲。單蟲的感染率最高為40.41％，兩蟲的混合感染率為11.66％，3蟲及以上的混合感染率為1.98％，其中混合感染最高的寄生蟲為阿米巴原蟲和鞭蟲。將收集的樣品按照飼養(yǎng)方式不同分為野生型、圈養(yǎng)型和動(dòng)物園型的飼養(yǎng)方式，其感染率分別為70.47％、55.99％和42.76％，不同飼養(yǎng)方式之間非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腸道

4、寄生蟲的感染情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)，野生型的猴類感染率最高。
　　為建立流式細(xì)胞儀檢測(cè)卡耶坦環(huán)孢子蟲卵囊的方法，將環(huán)孢子蟲卵囊液和陰性對(duì)照液按一定比例混合，分別制備不同濃度的卵囊液，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組分別經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選檢測(cè)，每次分析的常量設(shè)定為20000個(gè)事件，選定聚集區(qū)域R1且在488 nm光譜下能自發(fā)藍(lán)色熒光區(qū)域R2的事件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，環(huán)孢子蟲卵囊液濃度低于1048.6個(gè)/mL時(shí)，卵囊事件量

5、與陰性卵囊液中雜質(zhì)事件量無差異，流式細(xì)胞儀對(duì)環(huán)孢子蟲卵囊量的平均檢測(cè)限在34～90.8個(gè)之間，即流式細(xì)胞儀在檢測(cè)臨床患者糞便時(shí)，分析20000個(gè)事件，在設(shè)定的參數(shù)下，事件發(fā)生數(shù)在34～90個(gè)之間即可判定為疑似，事件發(fā)生數(shù)在91個(gè)及以上即可診斷為環(huán)孢子蟲感染。
　　為鑒定和比較2007-2013年期間河南省的顯微鏡檢測(cè)到的84份環(huán)孢子蟲分離株與GenBank上不同地區(qū)的環(huán)孢子蟲分離株之間的進(jìn)化關(guān)系，基于18S rRNA基因和ITS-

6、1基因的PCR測(cè)序結(jié)果，采用clustal X和MEGA等生物學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行生物種系發(fā)育分析和同源性分析。18S rRNA基因種系發(fā)育結(jié)果顯示，所有的人環(huán)孢子蟲分離株均在同一分支上，且與已經(jīng)提交的人環(huán)孢子蟲分離株(AF111183)只有一個(gè)堿基差異。ITS-1基因的種系發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，從河南分離的人環(huán)孢子蟲與從危地馬拉，尼泊爾，秘魯和海地等不同地區(qū)提交的環(huán)孢子蟲ITS-1基因序列差異較大。同時(shí)也顯示不同分離株之間的ITS-1基因序列具有較

7、大的變異性。
　　為了解河南省奶牛環(huán)孢子蟲的感染情況，從河南省11個(gè)不同的奶牛場(chǎng)采集了1229份奶牛糞便樣品，采用顯微鏡直接觀察和飽和蔗糖漂浮方法檢測(cè)。提取樣品的基因組DNA進(jìn)行18S rRNA基因部分序列的PCR擴(kuò)增，為區(qū)分環(huán)孢子蟲和艾美爾球蟲，設(shè)計(jì)了一種限制性內(nèi)切酶BSpEⅠ進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析與艾美球蟲屬區(qū)分。共發(fā)現(xiàn)44份陽性樣品，環(huán)孢子蟲的總感染率為3.58％，其中感染率最高為8周齡組，其感染率為

8、9.6％?；?8S rRNA基因的種系發(fā)育分析表明，從河南省奶牛體內(nèi)分離的環(huán)孢子蟲與從廣州分離的Guangzhou1株和從日本分離的Cyclospora sp.Oita株在同一個(gè)分支上。本次試驗(yàn)通過對(duì)奶牛環(huán)孢子蟲病的流行病學(xué)和分子生物學(xué)的研究，為其生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究和防治奠定了理論基礎(chǔ)。
　　本次研究對(duì)我國部分地區(qū)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腸道寄生蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查，建立了流式細(xì)胞儀檢測(cè)環(huán)孢子蟲卵囊的方法，并對(duì)人環(huán)孢子蟲和奶牛環(huán)孢子