桃膠多糖降血糖機制的研究.pdf

1、1.研究背景:
　　 糖尿病(DM)是一組由遺傳和環(huán)境等多因素共同引起的以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。胰島素缺乏和胰島素作用障礙單獨或同時引起糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等的代謝紊亂，臨床以慢性高血糖為主要特征，急性并發(fā)癥有酮癥酸中毒、高滲性高血糖狀態(tài)和乳酸性酸中毒。糖尿病可并發(fā)多種慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致器官功能障礙和衰竭，甚至致殘和致死，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，糖尿病的發(fā)病率不斷升高，預(yù)計到2025年全世界糖尿病患者將增至3億。

2、尤其發(fā)展中國家發(fā)病率迅速增加，我國糖尿病患者人數(shù)僅次于印度，目前已達9000多萬人次。糖尿病的慢性并發(fā)癥多且較為嚴(yán)重，隨著病程的延長，主要表現(xiàn)為冠心病、腦血管和外周血管病變、腎病和視網(wǎng)膜病變等。2型糖尿病占DM發(fā)病率的90％，2型DM的基本特征是胰島素分泌不足和胰島素抵抗，后者與肥胖和代謝綜合征有關(guān)。糖尿病前期，即空腹血糖受損和糖耐量受損狀態(tài)，占所有人群的10％以上，臨床上主要表現(xiàn)為餐后血糖升高，早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)，即降低餐后高血糖，可

3、以逆轉(zhuǎn)這種狀態(tài)，防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)我國在1998年和2006年的兩次橫斷面調(diào)查表明，有90％和73％的2型糖尿病患者糖化血紅蛋白(HbAlc)沒有達到理想的控制目標(biāo)[1]。雖然傳統(tǒng)西藥控制血糖和血脂效果明顯，但往往產(chǎn)生許多副作用，且不能治愈疾病，所以，長期、有效的預(yù)防和控制相關(guān)慢性疾病是延遲并發(fā)癥發(fā)生，提高患者生命質(zhì)量和生活質(zhì)量的重要措施。對糖耐量異常、糖尿病早期病人以及血脂升高的早期病人，降糖、降脂類保健食品將起到積極的預(yù)防保

4、健作用。有鑒于此，本項目組提出了利用天然桃膠開發(fā)輔助降糖和降脂保健食品的課題。
　　 桃膠(peach resin)是桃樹（薔薇科植物）的樹干受機械損傷（如蟲咬、切傷等）或致病后分泌出來的膠質(zhì)半透明物質(zhì)。其主要成分是多糖、蛋白質(zhì)等，其他物質(zhì)含量極少。其多糖由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等成分組成。丁婷等[9]等前期研究證實喂食原桃膠能夠降低糖尿病模型大鼠的血糖，且呈一定的量效關(guān)系。由于桃膠多糖是大分子的有機化合物，不能被

5、人體上消化道的消化酶消化，故其發(fā)揮作用主要是在腸道內(nèi)。洪郁之等[10]認(rèn)為原桃膠延緩腸道對糖的吸收，最終導(dǎo)致餐后血糖下降，血中胰島素水平下降。本課題組成員王飛等研究表明[11]，桃膠多糖的降糖機制之一是桃膠多糖不能被人體腸道的主要消化酶消化;并且桃膠多糖可以抑制體內(nèi)的淀粉酶和麥芽糖酶活性，延緩腸道內(nèi)碳水化合物的消化和吸收，達到降血糖的目的;在四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型上，發(fā)現(xiàn)三種不同分子量的桃膠多糖均能顯著降低糖尿病大鼠的空腹和餐后2

6、h血糖水平，三種分子量的桃膠多糖降糖效果比較無顯著差異，降糖效果與阿卡波糖相比較無顯著差異。
　　 多糖是一類由十個及以上單糖組成的復(fù)雜的大分子化合物，在自然界中來源甚廣，有細(xì)菌多糖、植物多糖、真菌多糖和動物多糖等。近十多年來，對多糖降血糖的研究越來越多，多糖降血糖的機制主要集中在以下幾個方面[2-8]:①改善胰島細(xì)胞形態(tài)和功能，促進胰島素分泌;②提高胰島素敏感性;③改善糖代謝，促進肝臟、肌肉等外周組織和靶器官對糖的利用;④調(diào)節(jié)

7、自身免疫，清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化;⑤改善糖代謝相關(guān)酶活性;⑥抑制α葡萄糖苷酶活性，延緩葡萄糖吸收。然而，由于除淀粉外的多糖本身的分子質(zhì)量以及結(jié)構(gòu)，決定了其不能被人體消化道內(nèi)的消化酶所分解，也就無法完整的進入到血液中發(fā)揮降血糖的功效，其發(fā)揮降血糖的作用在腸道內(nèi)。由此推斷，關(guān)于動物口服多糖直接改善胰腺功能、改變糖利用等的推論觀點并不能解釋消非淀粉類多糖影響體內(nèi)代謝的真正機制，這也是目前中藥領(lǐng)域關(guān)于非淀粉類多糖降糖機制值得探討的一個問題。

8、
　　 從分子結(jié)構(gòu)上分析，單糖與多糖相似，單糖的吸收是主動運轉(zhuǎn)的形式，作用于腸道的多糖類物質(zhì)是否能夠通過競爭抑制而影響單糖的主動轉(zhuǎn)運，影響腸道對于葡萄糖的吸收，達到降低血糖作用，可能是多糖降低血糖的另外機制之一。檢索國內(nèi)外文獻未見報道。
　　 Caco-2(human colon adenocarcinoma cell lines)細(xì)胞系是目前研究藥物腸道吸收的主要模型之一，能夠表達營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要載體和相關(guān)酶類，包括

9、葡萄糖吸收的主要載體SGLT-1，已成為預(yù)測藥物在人體小腸吸收和藥物載體吸收研究的標(biāo)準(zhǔn)體外篩選工具。本研究使用caco-2單層細(xì)胞模型模擬腸道上皮SGLT-1吸收葡萄糖的過程，并采用桃膠多糖干預(yù)的方法，探討桃膠多糖是否存在抑制葡萄糖吸收而具有降低血糖的作用。桃膠多糖腸道內(nèi)的降糖機制是否能夠通過競爭性抑制SGLT-1對葡萄糖的主動轉(zhuǎn)運、是否能夠刺激腸促胰島素分泌等達到降血糖效果，以及是否能夠在腸道內(nèi)抑制脂類物質(zhì)的吸收以降低血脂等其他作用還

10、有待進一步研究。
　　 2.研究方法:
　　 2.1.多糖的提取、分離[14]
　　 將購買的新鮮桃膠去雜、漂洗后進行冷凍干燥，干燥的桃膠經(jīng)超微粉碎后，得到原桃膠粉。取上述原桃膠粉加入蒸餾水，90℃水浴鍋，水浴4h后攪拌提取，重復(fù)一次。合并兩次浸提液，4000r/分離心20分鐘得上清液。將上清液于60℃真空濃縮至原體積1/5。脫蛋白法一:將氯仿和丁醇溶液按v∶v=5∶1的比例加到濃縮液中，混合物劇烈振搖5 min

11、后靜置萃取，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，得脫蛋白糖液，反復(fù)多次至水與溶液層交界處無明顯蛋白沉淀為止。采用梯度醇沉法在上述脫蛋白糖液加入無水乙醇至80％沉淀，重復(fù)多次加入，直至沒有產(chǎn)生沉淀為止，冷凍干燥，得到乙醇濃度沉淀的桃膠多糖。
　　 2.2.一般細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2.3.細(xì)胞毒性的測定(MTT實驗)
　　 2.4.caco-2細(xì)胞模型的建立[15]
　　 當(dāng)細(xì)胞傳至第20～30代時，取處于對數(shù)生

12、長期生長良好的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，HBSS液沖洗3次后，用胰酶消化，適量完全培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并置于800rpm的離心機中離心3～5min。棄去上清液，并加入適量完全培養(yǎng)液，用細(xì)胞計數(shù)板于倒置顯微鏡下進行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×105～5×105個/mL。按照每孔一定的細(xì)胞濃度接種于Transwell多聚碳酸酯膜培養(yǎng)板上(corning，3413)。第一周隔天換液，一周后每天換液，換液時注意不要吸附到貼于膜上的細(xì)

13、胞，以保證細(xì)胞完全貼壁以形成完整的膜結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)至21～23天。
　　 2.5.caco-2細(xì)胞模型的鑒定
　　 細(xì)胞接種于Transwell板上后，于培養(yǎng)第1、3、6、9、11、15、19、22天時用細(xì)胞電阻儀測定跨膜電阻值(TEER)，以了解細(xì)胞單層完整性及緊密性形成過程。
　　 2.6.桃膠多糖對Caco-2細(xì)胞吸收葡萄糖影響的研究方法
　　 取經(jīng)檢測合格的caco-2細(xì)胞單層模型，首先吸凈Trans

14、well系統(tǒng)中AP側(cè)以及BL側(cè)的培養(yǎng)液，吸凈后用適量HBSS液(PH=7.4)沖洗兩側(cè)各2次，第二次沖洗時放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中平衡20min。根據(jù)實驗分組稱取葡萄糖和桃膠多糖適量，并用HBSS液溶解混勻，并過濾消毒，使用之前先預(yù)熱至37℃。加藥前用MTT（噻唑藍）對0.125～1ug/ml桃膠多糖進行細(xì)胞毒性考察，實驗未見桃膠多糖對細(xì)胞有毒性。把含有葡萄糖和（或）桃膠多糖的HBSS液0.1ml加入到AP側(cè)，BL側(cè)加入0.7ml作為

15、接收液，放入培養(yǎng)箱中孵育。期間吸取AP側(cè)液體適量，測定葡萄糖的剩余量。按照吸取的量，重新補齊相等的液體量入AP側(cè)小室中。
　　 2.6.1一定濃度桃膠多糖對不同濃度葡萄糖吸收的影響的研究方法
　　 在Caco-2細(xì)胞單層模型上，不同濃度的葡萄糖HBSS溶液(0，10，15，20，25mmol/L)并各加入1ug/ml桃膠多糖溶液為實驗組，對照組則不加入桃膠多糖，作用不同時間后(0，30，60，90，120min)，用葡萄

16、糖[GOPOD法]檢測試劑盒檢測葡萄糖在液體中的剩余量，從而推斷桃膠多糖影響下不同濃度葡萄糖與Caco-2細(xì)胞結(jié)合情況。
　　 2.6.2.不同濃度的桃膠多糖對一定濃度葡萄糖吸收量影響的研究方法
　　 為進一步探討不同濃度的桃膠多糖對于相同葡萄糖濃度的影響是否有差異，將桃膠多糖分成1，0.5，0.25，0.125ug/ml四個濃度組，每個組樣本量5個，分別加入20mmol/L葡萄糖HBSS溶液，以空白的20 mmol/L

17、葡萄糖組為對照，余方法如前。
　　 2.7.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 各組數(shù)據(jù)以(X)±S表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。MTT實驗組間比較使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，其余采用單個重復(fù)測量因素的方差分析方法進行統(tǒng)計。
　　 3.結(jié)果:
　　 3.1.桃膠多糖的提取、分離
　　 通過采用水浴鍋浸提、Sevage法脫蛋白（或木瓜蛋白酶脫蛋白）、乙醇沉淀的方法得到相對較純

18、的桃膠多糖，所得桃膠多糖經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱純化，研磨粉碎后，狀態(tài)為灰褐色固體粉末，得率為50％左右。
　　 3.2caco-2細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)
　　 體外培養(yǎng)的caco-2細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶中時，單個細(xì)胞生長呈扁平狀多角形，胞體中央可見圓形細(xì)胞核，并逐漸生長為膜狀單層細(xì)胞，細(xì)胞之間緊密連接，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)檎R方形或圓形，整體呈“鋪路石樣”形態(tài)。將20-30代培育的細(xì)胞接種于Transwell多聚碳酸酯膜培養(yǎng)孔上后，經(jīng)

19、過約21天的培養(yǎng)，細(xì)胞分化形成微絨毛及連接復(fù)合體，建立更緊密的連接及良好的刷狀緣后，即成為可靠的單層細(xì)胞吸收模型。
　　 3.3細(xì)胞毒性試驗結(jié)果
　　 用HBSS液體配置的桃膠多糖溶液，濃度分別為(4，2，1，0.5，0.25，0.125ug/ml)，加入到96孔板中行MTT試驗，以研究其對caco-2細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，桃膠多糖溶液濃度在0.125～1ug/ml時，與陰性對照組之間比較無顯著性差異(P＞0.05，

20、n=6)，即0.125～1ug/ml桃膠多糖對caco-2細(xì)胞無明顯毒性作用。
　　 3.4 caco-2細(xì)胞單層模型驗證
　　 細(xì)胞接種于Transwell板上后，用細(xì)胞電阻儀測定跨膜電阻值(TEER)，可見TEER值隨培養(yǎng)天數(shù)增加而上升，21天后TEER值均大于600以上，符合實驗要求。
　　 3.5一定濃度桃膠多糖對不同濃度葡萄糖吸收的影響
　　 實驗組分別加入1ug/ml桃膠多糖后，對照組不加入桃

21、膠多糖，葡萄糖濃度為10，15，20，25 mmol/L，分別于30，60，90，120min時檢測葡萄糖值。10 mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃膠多糖組與對照組相比，葡萄糖的吸收有顯著差異(P=0.000);15 mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃膠多糖組與對照組相比，葡萄糖的吸收有顯著差異(P=0.000);20 mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃膠多糖組與對照組相比，葡萄糖的吸收有顯著差異(P=0.001);20 mmol/L

22、葡萄糖加1ug/ml桃膠多糖組與對照組相比，葡萄糖的吸收有顯著差異(P=0.001＜0.05);25 mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃膠多糖組與對照組相比，葡萄糖的吸收有顯著差異(P=0.009)。由此可知，即桃膠多糖對不同濃度的葡萄糖吸收均有抑制作用。
　　 對各實驗組葡萄糖吸收量隨時間變化的結(jié)果進行兩兩比較，結(jié)果顯示，不同實驗組之間葡萄糖吸收均有顯著差異(P=0.000)，說明實驗組葡萄糖濃度越小，桃膠多糖抑制葡萄糖吸收的

23、效果越好。
　　 Mauchly球形檢驗統(tǒng)計量W=0.507，P=0.076，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗方法時無需ε校正。
　　 3.6不同濃度的桃膠多糖對一定濃度葡萄糖吸收量的影響
　　 與對照組相比，不同濃度的桃膠多糖溶液(0.5，0.25，0.125ug/ml)對于一定濃度的葡萄糖(20mmol/L)吸收均有抑制效果(P＜0.05)，結(jié)果見表2。
　　 結(jié)果顯示，不同桃膠多糖濃度組葡萄糖吸收量隨

24、時間變化的關(guān)系見圖2，說明桃膠多糖濃度越高，葡萄糖的吸收量越少，抑制葡萄糖吸收的效果越好(P＜0.05)。
　　 Mauchly球形檢驗統(tǒng)計量W=0.256，P=0.001，拒絕球形假設(shè)，Greenhouse-Geisser校正，不同實驗組的4個時間點葡萄糖吸收有顯著性差異(F=934.31，P=0.000)。
　　 4.研究結(jié)論:
　　 1.由于桃膠多糖是由十個以上單糖通過糖苷鍵緊密結(jié)合形成的大分子化合物，桃膠

25、多糖不能被人體上消化道消化吸收，故桃膠多糖發(fā)揮降低血糖的作用部位在腸道內(nèi)而非血液。
　　 2.體外建立的caco-2模型，排除了腸道消化酶、腸道基底側(cè)GLUT-2和腸道菌群等因素對多糖分解和單糖吸收的影響，通過影響上消化道刷狀緣側(cè)葡萄糖吸收的的轉(zhuǎn)運蛋白SGLT-1的結(jié)果，提示桃膠多糖可能通過結(jié)合葡萄糖吸收的位點，從而延緩葡萄糖的吸收，達到降低餐后血糖的作用。
　　 3.桃膠多糖抑制葡萄糖吸收的效果表現(xiàn)出濃度依賴性，由此可