棉花GhTED2基因的克隆和功能分析.pdf

1、細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種由細(xì)胞內(nèi)基因控制的為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自主衰亡過程。植物維管系統(tǒng)在植物組織各部分的聯(lián)結(jié)方面起著重要的作用，它是由機(jī)械組織、輸導(dǎo)組織、分生組織和薄壁組織四部分組成的，具有貯存和運(yùn)輸物質(zhì)、機(jī)械支持、傳遞信息、阻止真菌和其它寄生物入侵等功能。在高等植物中，輸導(dǎo)組織的主要代表是韌皮部和木質(zhì)部。木質(zhì)部是由木薄壁細(xì)胞、木纖維和管狀分子(tracheary element，TE)

2、組成的，管狀分子TE是一種高度特化的細(xì)胞。從PCD被引進(jìn)植物生物學(xué)以來，許多研究都已經(jīng)證明TE的分化是一種典型的PCD過程，但它含有一般細(xì)胞PCD所沒有的次生壁構(gòu)建過程，因而不屬于常規(guī)意義上的PCD[1,2]。近些年來，維管組織分化的研究已經(jīng)從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)展到了分子水平。相關(guān)學(xué)者已從百日草(Zinnia elegans)葉肉細(xì)胞體外分化形成TE的過程中，克隆出了4個(gè)TE相關(guān)基因(TED1～4)[1,3]。其次，百日草葉肉細(xì)胞分化成木質(zhì)部

3、管狀分子的實(shí)驗(yàn)表明，TED2屬于編碼細(xì)胞NADPH氧化還原酶的一個(gè)基因，它的表達(dá)受到油菜素類固醇、Ca2/鈣調(diào)素等多種因子的正調(diào)控，其調(diào)控反應(yīng)產(chǎn)生H2O2和O2，能夠誘發(fā)木質(zhì)部管狀分子(tracheary element，TE)的PCD。
　　本研究?jī)?nèi)容主要涉及棉花GhTED2基因的克隆和構(gòu)建該基因相應(yīng)的表達(dá)載體，并進(jìn)行煙草的轉(zhuǎn)化，得到該基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行功能鑒定。具體的研究方法是以已知的陸地棉cDNA文庫中的包含5'端

4、序列部分的TED2基因序列為基礎(chǔ)，利用3' RACE技術(shù)得到陸地棉TED2基因的3'端序列，首次從陸地棉中成功擴(kuò)增出了全長(zhǎng)為1371bp的陸地棉TED2cDNA全長(zhǎng)序列，其中ORF為975bp，共編碼324個(gè)氨基酸（NCBI收錄號(hào)為FJ372981.1）。分別采用RT-PCR半定量法和Real-time PCR定量法對(duì)TED2基因在陸地棉根、莖、葉各組織中的表達(dá)量進(jìn)行的分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因在陸地棉根、莖、葉各組織中均表達(dá)，其中在早期

5、發(fā)育的陸地棉根和葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。利用植物表達(dá)載體pBI121作為骨架，將陸地棉TED2基因引入，構(gòu)建成植物表達(dá)基因pBI121-TED2（簡(jiǎn)寫為pBTED2），該基因由組成性表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因不定芽進(jìn)行選擇和根的再生，共獲得80個(gè)轉(zhuǎn)基因再生株。利用PCR初步篩查共獲得68株為轉(zhuǎn)基因PCR陽性株，進(jìn)一步的分子檢測(cè)結(jié)果表明TED2基因已經(jīng)成功的整合到轉(zhuǎn)基因煙草基因組中并在煙草中成功的進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。同