豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株的建立和鑒定.pdf

1、異種移植是解決臨床器官供體短缺的重要思路。目前認(rèn)為豬是異種移植較為合適的供體,而急性血管排斥反應(yīng)是異種移植的主要障礙。異種移植物的血管內(nèi)皮細(xì)胞是免疫排斥反應(yīng)首先攻擊的對(duì)象,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是介導(dǎo)和放大免疫排斥和凝血功能紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為研究異種移植中豬動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷、活化機(jī)制以及在異種移植中的作用,為保護(hù)和延長(zhǎng)異種移植物存活時(shí)間必需獲得豬的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,而我國(guó)目前尚無(wú)成熟的豬動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株,因此該實(shí)驗(yàn)通過(guò)膠原酶消化法獲取了豬原代主動(dòng)脈內(nèi)皮

2、細(xì)胞,用攜帶SV40LT基因的慢病毒轉(zhuǎn)染豬原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物、管狀成形能力和免疫學(xué)功能對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行了鑒定,并與原代細(xì)胞進(jìn)行比較,建立了可長(zhǎng)期傳代且表型穩(wěn)定的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株,該細(xì)胞株保持了原代細(xì)胞的基本特征,具備一般在體血管內(nèi)皮細(xì)胞的絕大部分功能,為異種移植研究提供了細(xì)胞水平研究平臺(tái)。
　　目的:
　　建立豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株,為以豬為供體的異種移植研究提供必要的細(xì)胞水平研究平臺(tái)。
　　方法:<

3、br>　　1.原代內(nèi)皮細(xì)胞的提取和細(xì)胞株的建立:用膠原酶消化法分離豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,并用攜帶SV40LT基因的慢病毒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞,建立細(xì)胞株。
　　2.細(xì)胞基本特征鑒定:在形態(tài)學(xué)上,通過(guò)倒置顯微鏡和電子顯微鏡分別觀察了原代細(xì)胞和細(xì)胞株的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu);通過(guò)MTT法測(cè)定了兩類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;RT-PCR檢測(cè)了兩類(lèi)細(xì)胞中SV40LT基因表達(dá)情況;免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法檢測(cè)了兩類(lèi)細(xì)胞表達(dá)vWF因子的能力;熒光顯微鏡下觀察了兩類(lèi)細(xì)胞吞

4、噬DiI-Ac-LDL的能力;檢測(cè)了兩類(lèi)細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠中的管狀成形能力。
　　3.免疫學(xué)特性檢測(cè):RT-PCR測(cè)定了兩類(lèi)細(xì)胞中α-1,3-GT基因的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了兩類(lèi)細(xì)胞中α-1,3-Gal抗原表達(dá)情況;兩類(lèi)細(xì)胞與人血清共培養(yǎng)后,MTT法檢測(cè)了人血清對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了人血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合人IgG抗體和補(bǔ)體C3、C5b-9的能力。
　　結(jié)果:

5、
　　1.成功分離和培養(yǎng)了原代豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),細(xì)胞為梭形、橢圓形或不規(guī)則形;電鏡下細(xì)胞表面有絨毛凸起和W-P小體;內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)vWF因子并可吞噬DiI-Ac-LDL;內(nèi)皮細(xì)胞具有管狀成形能力。
　　2.用攜帶SV40LT慢病毒成功轉(zhuǎn)染了原代細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株高表達(dá)SV40LT基因;原代細(xì)胞倍增時(shí)間約為21h,而細(xì)胞株倍增時(shí)間約18h;細(xì)胞株在形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物、吞噬DiI-Ac-LDL能力

6、以及管狀成形能力與原代內(nèi)皮細(xì)胞相似。
　　3.在免疫學(xué)特性上,α-1,3-GT基因和α-1,3-Gal抗原在兩類(lèi)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)無(wú)差異(熒光強(qiáng)度分別為(498.2士3.5)和(500.6士3.2),P>0.05),且均高于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(P<0.05)。與人血清共培養(yǎng)時(shí),隨血清濃度升高,兩類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力下降、細(xì)胞凋亡率增加,并均可結(jié)合人IgG抗體和補(bǔ)體C3和C5b-9(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　實(shí)驗(yàn)提取的原代