減毒沙門氏菌為載體的CD40基因疫苗對實驗性大腸癌生長的影響.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分:重組大鼠CD40基因真核表達載體的構建及功能鑒定
　　目的:構建含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達質粒。
　　方法:從大鼠的脾臟組織中完整克隆出大鼠CD40基因全長，成功構建真核表達質粒pIRES2-EGFP-CD40，通過脂質體介導轉染COS7細胞，免疫雙熒光法檢測CD40的表達。
　　結果:成功構建真核表達質粒pIRES2-EGFP-CD40并轉染COS

2、7細胞，證明真核表達質粒pIRES2-EGFP-CD40在COS7細胞中能夠穩(wěn)定表達目的基因。
　　結論:成功構建了含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達質粒。
　　第二部分:含pIRES2-EGFP-CD40質粒減毒沙門氏菌的構建及功能鑒定
　　目的:構建含pIRES2-EGFP-CD40質粒的減毒沙門氏菌菌疫苗。
　　方法:采用電轉化法將pIRES2-EGFP-CD40質粒成功轉入鼠傷寒沙門氏菌(L

3、B5000)，經過甲基化修飾后的pIRES2-EGFP-CD40質粒通過電轉化轉入終宿主菌SL3261，通過抗生素篩選法挑取單個菌落進行擴增，最終抽提質粒并進行PCR鑒定。
　　結果:終宿主菌SL3261在電轉化轉入pIRES2-EGFP-CD40質粒后，通過質粒抽提和FCR鑒定證實，其所獲得的目的條帶與原轉化質粒條帶大小相同。
　　結論:成功構建了能攜帶大鼠CD40基因真核表達質粒pIRES2-EGFP-CD40的SL32

4、61疫苗菌。
　　第三部分:含pIRES2-EGFP-CD40質粒減毒沙門氏菌對大鼠大腸癌生長的影響
　　目的:探討減毒沙門氏菌為載體的CD40基因疫苗對荷瘤大鼠免疫系統(tǒng)的影響及治療大腸癌可行性。
　　方法:雄性6-8周齡SD大鼠18只隨機分為3組，分別為SL3261組、空質粒（pIRES2-EGFP）組以及CD40（pIRES2-EGFP-CD40）組。對全部大鼠應用1，2-二甲肼連續(xù)皮下注射18周以構建大鼠大腸癌實

5、驗模型，分別于第8周、第10周、第12周及第16周根據(jù)所分組別不同共四次灌服SL3261、pIRES2-EGFP/SL3261和pIRES2-EGFP-CD40/SL3261，于18周后處死全部實驗大鼠，將大鼠瘤體解剖后觀察并記錄瘤體大小、瘤體數(shù)量、有無轉移灶等，根據(jù)觀察指標進行Dukes分期;流式細胞儀檢測外周血和脾臟細胞表型，PHA刺激脾臟細胞72小時后培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量通過ELISA法檢測，脾臟細胞中GFP的轉錄表達通過R

6、T-PCR進行檢測。
　　結果:CD40組平均成瘤數(shù)為5.8±2.2個，明顯低于SL3261組的12.7±3.1和空質粒組的11.6±2.4（P＜0.05)，空質粒組和SL3261組兩組的成瘤數(shù)相比較無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;脾臟細胞和外周血表型檢測顯示CD40組的活化T細胞CD3+CD8+數(shù)量較其它荷瘤組明顯增高(P＜0.05)，PHA刺激脾細胞試驗結果證實空質粒組和SL3261組分泌IFN-γ的能力也明顯低于CD40組