玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPTF1基因的功能分析.pdf

1、bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在高等植物不同組織中廣泛存在并且參與眾多代謝過(guò)程的調(diào)控。ZmPTF1是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，有研究表明ZmPTF1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控碳代謝和根的生長(zhǎng)增加了玉米對(duì)低磷的耐性，對(duì)低氮、干旱和高鹽等逆境也有明顯應(yīng)答。并且過(guò)表達(dá)ZmPTF1導(dǎo)致玉米根部大量基因表達(dá)發(fā)生變化。這些表達(dá)發(fā)生差異的基因涉及多個(gè)代謝途徑，如PAMPs誘發(fā)的抗病途徑、次生代謝途徑、激素代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、碳水化合物代謝途徑等。
　　本實(shí)驗(yàn)以前人從

2、玉米A318中克隆的一個(gè)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子ZmPTF1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行了分析。并構(gòu)建植物表達(dá)載PCAMBIA3301-ZmPTF1，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入煙草，研究基因的生物學(xué)功能。此外還對(duì)ZmPTF1蛋白的靶基因進(jìn)行了初步篩選主要研究結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)ZmPTF1基因的啟動(dòng)子的順式作用元件及其預(yù)測(cè)蛋白蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明該區(qū)域存在多個(gè)激素應(yīng)答元件、多種生物和非生

3、物脅迫應(yīng)答元件、光反應(yīng)應(yīng)答相關(guān)元件及一些基礎(chǔ)代謝相關(guān)元件。其蛋白質(zhì)由481個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，為疏水性蛋白。
　　2.將已構(gòu)建好的原核表達(dá)載體PET-32a-ZmPTF1轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到大約52.5KDa的ZmPTF1/His融合蛋白。
　　3.運(yùn)用Pull-down方法以玉米總DNA為目標(biāo)，以原核表達(dá)出的ZmPTF1/His融合蛋白為誘餌篩選能與其結(jié)合的靶基因片段，得到15個(gè)不同的序列。經(jīng)測(cè)序

4、比對(duì)分析，篩選出10個(gè)可能的ZmPTF1靶片段。候選靶基因主要涉及了激素合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，生物和非生物脅迫應(yīng)答，生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等方面。
　　4.構(gòu)建植物表達(dá)載體PCAMBIA3301-ZmPTF1，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草。PCR鑒定得到17株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性煙草。對(duì)生長(zhǎng)正常的T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行southern雜交分析及RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明外源ZmPTF1已經(jīng)整合進(jìn)了煙草基因組中并且能正常轉(zhuǎn)錄并遺傳。
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