大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞樣細胞的研究.pdf

1、目前對于終末期肝病和部分遺傳性肝病缺乏理想的治療措施，以補充功能性肝細胞為思路的細胞治療和生物人工肝即是一個大膽、有益的嘗試。但因肝細胞不能取材于自體，且同種肝細胞數(shù)量和保存時間有限，使其臨床應(yīng)用受到限制。因此，必需尋找其他來源細胞替代肝細胞，成體干細胞多向分化潛能的發(fā)現(xiàn)給人們帶來了新的希望。成體干細胞中以骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）和臍血間充質(zhì)干細

2、胞（umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs）向肝細胞分化報道較多。自2001年Zuk等人[1]發(fā)現(xiàn)人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細胞以來，脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs）以其來源廣泛、取材方便、自體取材創(chuàng)傷小等獨特優(yōu)點而很快成為人們的研究熱點。研究表明ADMSC

3、s在適當條件下可以向脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞等方向誘導分化，而向肝細胞方向分化報道較少。脂肪間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化潛能的研究將有望為肝病的細胞治療和生物人工肝提供大量新的、很有前景的細胞來源。
　　本研究旨在通過體內(nèi)外不同誘導途徑探討ADMSCs向肝細胞分化的潛能。首先獲取大鼠脂肪組織，用膠原酶消化法分離出干細胞，并進行體外擴增、傳代；用免疫熒光染色法檢測其表面標志，并誘導ADMSCs向脂肪細胞、

4、成骨細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等方向分化，以鑒定所獲取的細胞是否為間充質(zhì)干細胞。
　　用成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF-4）和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）誘導其向肝細胞分化；倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，誘導后14天和21天分別用免疫熒光檢測法檢測肝細胞標志物白蛋白的表達，用尿素氮測試盒檢測培養(yǎng)上清液尿素氮含量。通過以上指標的測定，研究ADMSCs在

5、體外誘導條件下向肝細胞分化的能力。
　　隨后我們以同樣的方法從大鼠脂肪組織中分離出干細胞，并進行體外擴增、傳代，取第2代ADMSCs用PKH26標記，制作部分肝切除模型，將標記細胞經(jīng)門靜脈自體植入體內(nèi)。2周后切下肝臟制成冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察標記細胞在肝臟中的定位，免疫熒光染色檢測標記細胞白蛋白的表達。
　　結(jié)果表明，從脂肪組織所獲取的細胞經(jīng)免疫熒光檢測顯示其表面分子CD29（+），而CD31和CD45均為陰性，通過不同

6、的誘導方法細胞能夠被誘導向脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等方向分化，證實我們從脂肪組織獲取的細胞為具有多向分化潛能的干細胞；誘導14天后可逐漸觀察到肝細胞樣形態(tài)改變；免疫熒光檢測到白蛋白表達；尿素氮檢測顯示誘導組尿素氮含量隨時間延長而逐漸升高。從脂肪組織中分離出的ADMSCs能在體外大量擴增，PKH26標記后該細胞在熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光，細胞標記率約95％；熒光顯微鏡下可見肝臟冰凍切片中散在分布紅色標記細胞，免疫熒光染色顯示大多數(shù)標

7、記細胞白蛋白染色陽性。
　　綜上所述，通過我們的實驗方法，可以從大鼠脂肪組織中獲取具有多向分化潛能的干細胞，即脂肪間充質(zhì)干細胞（ADMSC），該細胞能在體外被誘導分化成形態(tài)、表型及功能與肝細胞相似的細胞；體內(nèi)移植實驗顯示，ADMSCs也能在部分肝切除后的肝再生環(huán)境中向肝細胞分化，有可能在肝部分切除后參與肝再生。
　　本研究通過體內(nèi)外實驗表明ADMSCs在適當條件可以被誘導分化為肝細胞，為ADMSCs在肝病的細胞治療、生物人工