棉蚜化學感受蛋白的基因克隆、動態(tài)時空表達及結(jié)合特征分析.pdf

1、昆蟲有著極發(fā)達的嗅覺系統(tǒng)，藉此識別環(huán)境中大量的化學信息并做出相應的生理和行為反應，如逃避天敵，尋找食物源、配偶和產(chǎn)卵場所等。在昆蟲嗅覺感受器腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種可溶性蛋白:氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)和化學感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)。CSPs是一類新的蛋白，可能與昆蟲識別外界化學信息有關(guān)，但其確切的生理功能仍未知。本文基于棉蚜Aphis gossypii轉(zhuǎn)錄組數(shù)

2、據(jù)，克隆得到了7條編碼化學感受蛋白(AgosCSP)的cDNA序列，測定了棉蚜化學感受蛋白的時空表達譜，并利用蛋白體外表達技術(shù)及熒光競爭結(jié)合實驗探討了AgosCSPs的生理功能。結(jié)果如下。
　　1.棉蚜化學感受蛋白的基因克隆及序列分析
　　結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并利用同源性較高的cDNA序列和RACE技術(shù)，克隆了棉蚜7個CSP基因的全長cDNA序列。7個基因分別命名為分別命名為AgosCSP1(GenBank登錄號:KC0177

3、50)、AgosCSP2(GenBank登錄號:KC017751)、AgosCSP3(GenBank登錄號:KJ451424)、AosCSP(GenBank登錄號:KJ451425)、AgosCSP8(GenBank登錄號:KC017753)、AgosCSP13(GenBank登錄號:FJ387488)、AgosCSP17(GenBank登錄號:KC017754)。序列分析表明，所有CSP均具有典型CSP的序列特征，其中包括4個保守的半

4、胱氨酸位點。
　　2.棉蚜化學感受蛋白動態(tài)時空表達分析
　　采用qRT-PCR技術(shù)對AgosCSPs在不同時期、不同蟲態(tài)的棉蚜中mRNA的表達量進行了分析，同時選取秋蚜無翅成蟲作為材料研究了AgosCSPs在秋蚜不同組織中的分布情況。試驗結(jié)果表明AgosCSPs表達分布較廣泛，在不同時期不同組織中都有表達，且表達是有差異的。推測其可能執(zhí)行者各種不同的生理功能。其中AgosCSP1在秋蚜無翅成蟲的表達量較高，結(jié)合其在足中表達量

5、顯著高于其他組織，推測其在寄主定位中有作用;AgosCSP2在越冬寄主木槿樹上的棉蚜中相對表達量較其他時期的棉蚜低，在取食棉花的伏蚜和秋蚜中表達量較高，推測該基因與棉蚜對寄主適應性有關(guān)。而AgosCSP2在相同時期、寄主相同的棉蚜若蟲中相對表達量高于成蟲表達量，暗示該基因主要參與棉蚜若蟲對寄主的適應過程;AgosCSP3在苗蚜無翅型表達量要顯著高于在其他時期，暗示該基因可能涉及對苗蚜無翅成蟲和無翅若蟲的行為影響。
　　3.棉蚜化學

6、感受蛋白的體外表達及純化
　　將PCR擴增的AgosCSPs目的產(chǎn)物連接到帶有與特異性引物相同酶切位點的表達載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建pGEX-4T-1/AgosCSPs重組表達載體。并選擇BL21(DE3)作為表達菌株，通過IPTG誘導進行原核表達。經(jīng)分析，表達出的蛋白全部為可溶性，經(jīng)親和層析、凝血酶處理后純化出6個高純度的棉蚜CSP蛋白。
　　4.棉蚜化學感受蛋白與配體結(jié)合能力分析
　　利用熒光競爭結(jié)合實驗的方