新城疫病毒降解線粒體抗病毒信號(hào)蛋白MAVS的機(jī)制研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起，可致多種禽類(lèi)死亡，給我國(guó)及世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。NDV為副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，單股負(fù)鏈RNA病毒，并且具有囊膜。其基因組結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別對(duì)應(yīng)編碼六種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
　　病毒感染細(xì)胞后各種各樣的免疫信號(hào)通路被激活，并產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)來(lái)對(duì)抗病毒感染。模

2、式識(shí)別受體（PRRs）中的RIG-Ⅰ樣受體（RLR）是細(xì)胞質(zhì)中一類(lèi)RNA解旋酶，它們可以通過(guò)其RNA配體結(jié)合病原相關(guān)分子模式（PAMP），識(shí)別非自身的病毒RNA。被感染的細(xì)胞中，這種相互作用可以通過(guò)觸發(fā)RLRs及包括MAVS在內(nèi)的其下游信號(hào)分子的活化，最終導(dǎo)致一型干擾素(IFN)的產(chǎn)生和炎性因子的產(chǎn)生，細(xì)胞做出抗病毒免疫應(yīng)答。然而，很多病毒通過(guò)保護(hù)自身RNA不被識(shí)別，或靶向RLR信號(hào)通路中的信號(hào)分子等作用，以逃避細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答。本

3、研究通過(guò)檢測(cè)NDV對(duì)MAVS的影響，來(lái)研究NDV對(duì)RLR信號(hào)通路的免疫逃避機(jī)制。
　　一、NDV感染細(xì)胞誘導(dǎo)MAVS降解
　　本研究分別使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細(xì)胞，檢測(cè)RIG-Ⅰ樣信號(hào)通路中重要的接頭分子MAVS的表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，三種毒株感染細(xì)胞前期都引起了MAVS表達(dá)水平的上調(diào)，而在感染后期都幾乎完全降解MAVS。說(shuō)明NDV在感染細(xì)胞前期強(qiáng)烈活化了RLR

4、信號(hào)通路的活化，而后期又幾乎完全破壞了RLR信號(hào)通路的信號(hào)的傳導(dǎo)。
　　二、NDV通過(guò)PCBP2非依賴途徑誘導(dǎo)MAVS降解
　　有研究已證明病毒可以通過(guò)上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS，并且有實(shí)驗(yàn)證明在敲低PCBP2的細(xì)胞中，NDV的復(fù)制受到抑制。為了驗(yàn)證NDV是否通過(guò)PCBP2降解MAVS，本實(shí)驗(yàn)使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細(xì)胞，檢測(cè)PCBP2的表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示

5、NDV并沒(méi)有明顯地上調(diào)PCBP2，在敲低PCBP2之后對(duì)NDV復(fù)制也沒(méi)有影響，而在過(guò)表達(dá)PCBP2之后MAVS的表達(dá)量沒(méi)有明顯的降低。該結(jié)果表明，NDV并非通過(guò)上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS。
　　三、NDV通過(guò)蛋白酶體途徑誘導(dǎo)MAVS的降解
　　以上實(shí)驗(yàn)已證實(shí)NDV可以降解MAVS，而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為一種重要的系統(tǒng)，可介導(dǎo)真核生物體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的降解。為了驗(yàn)證NDV引起的MAVS的降解是否為泛素化降解，本實(shí)驗(yàn)選擇

6、了MG132作為蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，使用蛋白酶體抑制劑之后，NDV引起的MAVS的降解受到了抑制，同時(shí)病毒的滴度也相應(yīng)的降低了，表明NDV引起的MAVS的降解是泛素化降解。
　　四、NDV病毒蛋白對(duì)MAVS降解檢測(cè)
　　為了驗(yàn)證NDV蛋白是否能直接降解MAVS，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ZJ1的P/V/W真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染ZJ1的PN/W真核表達(dá)質(zhì)粒以及實(shí)驗(yàn)室已有的Herts/33的P/M/NP真核表達(dá)質(zhì)粒后，檢測(cè)MAVS表