人KCTD9真核表達質粒及慢病毒表達載體的構建與鑒定.pdf

1、背景及目的：
　　我國乙型病毒性肝炎發(fā)病率高(約5％),在慢性乙型肝炎基礎上誘發(fā)的重型肝炎病情尤為兇險,病情進展迅速,病死率較高,可達到70%以上,一直備受臨床醫(yī)生和研究人員的重視。目前內科治療對于該疾病的作用有限,雖然肝移植是終末期肝病治療的最終選擇,但因我國面臨嚴重的供體短缺、移植價格昂貴等問題而受到臨床應用的限制,因此免疫治療為重型肝炎的治療提供了新的思路。重型乙型肝炎發(fā)病機制復雜,涉及到病毒和宿主雙重因素。其中免疫介導的肝

2、細胞損傷中,乙型肝炎病毒(HBV)抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)細胞的作用及機制已經得到較好闡明,而非特異性免疫在其中的作用卻尚不明確。本研究室的前期研究首次揭示肝臟自然殺傷細胞(NK細胞)在病毒誘導的肝損傷中發(fā)揮至關重要的作用。
　　本研究室前期通過基因芯片對重癥乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者的外周血單個核細胞的基因差異表達譜研究,發(fā)現離子通道相關基因--potassium channel tetramerisatio

3、n domain containing 9(KCTD9)在慢性乙肝的重癥階段患者的外周血單個核細胞(PBMC)中高度表達,是重型乙型肝炎的一個下調基因。進一步通過對我研究室建立的不同類型的小鼠肝炎模型和不同臨床類型的乙型肝炎患者(重型肝炎和輕中度慢性肝炎患者)及健康對照組患者外周淋巴細胞和肝淋巴細胞的表達研究發(fā)現,KCTD9表達水平在外周血NK細胞和肝臟NK細胞上顯著增高,其表達與重型肝炎患者肝臟受損的嚴重程度呈正相關。對鼠三型肝炎病毒

4、(MHV-3)誘導的Balb/cJ暴發(fā)型肝炎小鼠模型中干預KCTD9的表達,能夠有效抑制NK細胞活化及延緩暴發(fā)型肝炎的疾病進展。這一系列研究為進一步探討重癥肝炎的肝細胞損傷機制,提供了新的方向和疾病干預靶點。
　　為進一步研究KCTD9的免疫功能,本研究克隆了人KCTD9開放閱讀框(ORF)全長,構建其表達質粒。同時,為進行進一步的信號轉導途徑的相關研究,我們構建了該基因的慢病毒表達載體。這些均為KCTD9分子的功能研究提供了強有

5、力的前提保證,也為下一步的研究打下堅實的基礎。
　　研究方法：
　　1.收集重型乙型肝炎病人外周血,提取PBMC的總RNA,逆轉錄為cDNA后作為模板,PCR方法擴增KCTD9ORF區(qū),并連接到pcDNA3.1質粒上,轉化感受態(tài)細胞,陽性克隆PCR后小提質粒,進行雙酶切及雙向測序鑒定。
　　2.構建pGC-FU-KCTD9慢病毒載體,通過測序結果和利用westernblot技術從蛋白質方面鑒定含有KCTD9的目的片段的

6、表達。經過包裝純化,含目的基因的慢病毒顆?？梢垣@得較高滴度,為進行下一步的生物學功能研究做鋪墊。
　　研究結果：
　　1.觀察雙酶切的結果及測序結果證實從PBMC中獲得的KCTD9基因連接到pcDNA3.1載體上,除第693位堿基由胸腺嘧啶突變胞嘧啶為外,其余都與NCBI基因文庫中KCTD9基因切合,該處突變屬于同義突變,不會影響其蛋白質的空間結構及蛋白質的生理功能。
　　2.成功構建pGC-FU-KCTD9表達質粒,