食管鱗癌免疫組化標志物TP-Alpha,Collagen Alpha-1(VI)Chain和S100A9的鑒定.pdf

1、研究背景與目的：
　　 食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。據世界衛(wèi)生組織公布的最新資料顯示，2008年度全世界67億人口新發(fā)食管癌48.2萬例，發(fā)病率為7.0/10萬，居全部惡性腫瘤第9位；死亡40.7萬例，死亡率5.8/10萬，居第8位。其發(fā)病率具有明顯的地域差異，其中，東亞、東非和南非是高發(fā)地區(qū)，西非、中非及中美洲是低發(fā)區(qū)，兩者相差16倍。發(fā)病率的男女性別比為3～4倍。中國大陸13.4億人口中食管癌新發(fā)25.9萬例，發(fā)病率為

2、16.7/10萬，居全國各類惡性腫瘤第5位；死亡21.1萬例，死亡率為13.4/10萬，居第4位。食管癌的病理類型表現(xiàn)為中、上三分之一的鱗狀上皮細胞癌和下三分之一與胃食管交界處的腺癌。從中亞的伊朗北部到東亞的華中華南，是被稱為“食管癌帶”的食管癌高發(fā)區(qū)，90％以上是鱗狀上皮細胞癌。
　　 近幾十年來，盡管在食管癌的診斷與治療方面新技術、新手段層出不窮，但食管癌的預后并未明顯改善。究其原因在于半數以上的患者在首次就診時已屬于中晚期

3、，而這些患者即使行以手術為主的綜合治療，仍有40％～50％患者死于復發(fā)或轉移。食管早期癌治療后5年生存率高達90％～100％，而進展期癌5年生存率低至10％左右，這與現(xiàn)有治療方法對早期患者治療的有效性有關，因此，提高食管癌患者生存率關鍵在于早期診斷。
　　 作為食管鱗狀上皮細胞癌早期診斷的一項技術，食管拉網細胞學檢查已經應用于臨床，尤其是在食管癌高發(fā)區(qū)，針對大批無癥狀人群的篩查具有重要意義，但其靈敏度比較低(14％～36％)，目

4、前已被內鏡下診斷加病理活檢取代。理想的診斷診斷方法應該具備靈敏度高、特異性強、微創(chuàng)和簡便易行，不需要專家的特別解釋。內鏡活檢監(jiān)測具有侵襲性且價格昂貴，操作難度大，費時費力，不能滿足上述要求。目前多重活檢、福爾馬林固定后行免疫組化檢查，可以滿足上述需要。免疫組化可以對分子生物學標志物進行定性、定位及定量分析，是在組織水平上常用的診斷方法。目前用來預測可以發(fā)展為食管鱗狀上皮細胞癌的分子生物學標志物主要有MCM-2、cyclin-A等，但其診

5、斷的準確性較低，因此，鑒定食管鱗狀上皮細胞癌早期診斷新的分子生物學標志物是臨床亟待解決的問題。
　　 現(xiàn)在，高通量蛋白質組學技術可以描繪出疾病與對照之間全蛋白組水平上蛋白質的變化譜圖，可以把組織、血清等多種樣本作為研究對象。差異蛋白質組學通過對差異蛋白質的篩查特別適用于對疾病機制的研究，提供差異蛋白質的信息，進而鑒定出對疾病診斷、分子治療及預后判斷有關的分子生物學標志物。同位素試劑的差異標簽標記技術，比如同位素相對絕對定量試劑盒

6、(iTRAQ)結合多維液相色譜分離和串聯(lián)質譜在疾病標志物的篩查及鑒定中意義日漸突出。我們采用這一方法曾對結直腸癌差異蛋白進行研究，鑒定到一組有重要意義的結直腸癌標志物。本研究采用了iTRAQ試劑盒結合多維液相色譜分離及串聯(lián)質譜技術描繪了食管鱗狀上皮細胞癌癌組織與正常組織之間的差異蛋白質譜，旨在鑒定到對食管鱗狀上皮細胞癌有診斷意義的免疫組化標志物，以期提高早期診斷水平，進而改善患者預后。同時也為其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制研究提供新的線索。

7、
　　 方法：
　　 分別在手術中標本離體后收集5例食管鱗狀上皮細胞癌患者癌組織和遠端正常粘膜組織，蛋白提取后，分別將5例腫瘤樣本蛋白及5例正常粘膜樣本蛋白混合、胰酶消化后，以同位素相對與絕對定量試劑盒標記腫瘤和正常組織蛋白，混合后首先用強陽離子交換進行第一維的分離，根據峰型和時間共收取20個梯度，然后采用反相色譜與質譜聯(lián)用技術對樣品進行第二維的分離和蛋白質多肽質譜圖的獲取與定量，經數據庫搜索，描繪出食管鱗狀上皮細胞癌組

8、織差異蛋白質譜。搜索Swiss-Prot與GeneOntcology數據庫進行差異蛋白質亞細胞定位和功能分析。
　　 經生物信息學分析，在差異蛋白質譜中挑選一組蛋白，以免疫組織化學法檢測其表達水平。收集57例食管鱗狀上皮細胞癌癌組織和遠端正常粘膜組織，經福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，脫蠟至水、高壓抗原修復、雙氧水封閉內源性酶、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色及蘇木素復染后，采用雙盲法有兩位病理學醫(yī)師對結果進行診斷。診斷標準：在5

9、個視野觀察200個上皮細胞，對陽性細胞數和染色強度進行觀察并打分，兩者相加之和作為評分結果。根據陽性細胞百分比進行打分的標準：0,陰性；1，陽性細胞數<10％；2，陽性細胞數≥11％而<50％；3，陽性細胞數≥51％而<80％；4，陽性細胞數≥80％。根據染色強度進行打分的標準：0,無；1，弱陽；2，中等陽性；3，強陽性。
　　 另在手術中標本離體后收集3例食管鱗狀上皮細胞癌患者癌組織和遠端正常粘膜組織，蛋白提與定量取后，采用W

10、estern－Blot實驗驗證差異蛋白的表達。取30微克總蛋白行SDS-PAGE、轉膜、一抗孵育、二抗孵育后以電化學發(fā)光法顯示條帶，以PDQUEST軟件半定量分析。
　　 結果：
　　 采用同位素相對與絕對定量、蛋白質二維分離及質譜技術描繪早期食管鱗狀上皮細胞癌組織蛋白譜，共鑒定到712個蛋白，其中，P<0.05并且在癌組織與正常組織中含量比值≧1.5或≦0.67的蛋白質被認定為差異蛋白，共有39個蛋白(29個上調，10

11、個下調)。利于Swiss-Prot和GeneOntcology數據庫搜索，差異蛋白定位于細胞膜、細胞外基質、細胞漿和細胞核，其功能與結合、細胞結構、信號轉到、細胞粘附等相關。在這些差異蛋白質中，我們選擇了TP-alpha(HADHA)，Collagenalpha－1(VI)chain(COL6A1)和S100A9等3個高表達蛋白質進行免疫組化實驗，結果顯示：TP-alpha表達于77.19％腫瘤間質，腫瘤細胞及正常粘膜上皮細胞中不表達；

12、Collagenalpha－1(VI)chain表達于細胞外和細胞膜，癌組織中85.96％％陽性，正常組織中31.58％陽性，與正常組織相比，75.44％表達增高。S100A9表達于細胞漿，在89.47％的腫瘤組織與66.67％正常組織中陽性，在癌組織中呈現(xiàn)局灶狀團簇狀表達，與正常組織相比，表達升高者占59.65％。通過收受者特征曲線的曲線下面積分析，分別以免疫組化評分(2、3、3分)作為診斷標準，其診斷標準、靈敏度、特異度和曲線下面積

13、分別為：HADHA，≧2分，77.19％，100.00％和0.886％；COL6A1，≧3分，71.93％、85.96％和0.856％，和S100A9，≧3分，82.46％、43.86％和0.647％。Western-Blot實驗同樣證明了HADHA、COL6A1和S100A9在癌組織中的高表達。
　　 結論：
　　 我們初步描繪了食管鱗狀上皮細胞癌組織差異蛋白質譜，為食管癌發(fā)生發(fā)展機制及腫瘤標志物的研究提供新的線索。H