RhoGD12在肺癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：RhoGDI2是RhoGDIs家族成員之一。RhoGDIs家族是RhoGTPase活化的中心調(diào)節(jié)分子,各種蛋白,脂類及酶驅(qū)動RhoGDIs的替換活動,以調(diào)節(jié)RhoGTPase/RhoGDI之間親和力的動態(tài)變化。RhoGDI2是Theodorescu等人最先在膀胱癌上確定的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子,在進(jìn)一步的研究中他們發(fā)現(xiàn),RhoGDI2在大多數(shù)腫瘤起源的細(xì)胞系中的表達(dá)水平普遍低于相對應(yīng)正常組織,RhoGDI2在健康和疾病組織中的功能,效

2、應(yīng)靶點和生理作用仍不清楚。目前研究表明作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子,RhoGDI2的表達(dá)水平的變化趨勢,在不同類型的腫瘤以及同類腫瘤的不同研究層面不盡相同。這些研究結(jié)果都表明RhoGDI2可能和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),但是之間的確切關(guān)系仍然很不清楚,因此引起了人們極大的關(guān)注。
　　 對于肺癌,RhoGDI2作為與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子,在肺癌細(xì)胞系,肺癌組織的具體作用機(jī)制,國內(nèi)外尚無系統(tǒng)研究報道。我們通過免疫組織化學(xué)方法、RT-PCR

3、等方法,對RhoGDI2在肺癌組織mRNA和蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)行了的檢測;利用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光方法,對體外培養(yǎng)的不同類型的肺癌細(xì)胞系中RhoGDI2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)行了的檢測;并利用肺癌生長、侵襲轉(zhuǎn)移的經(jīng)典信號通路PI3K/Akt/mTOR上特異性的激動劑和拮抗劑,通過WesternBlot等方法來觀察RhoGDI2蛋白水平的變化,以進(jìn)一步分析RhoGDI2參與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移可能的機(jī)制。<

4、br>　　 方法：
　　 1、材料
　　 112例肺癌病例的石蠟切片及相應(yīng)的臨床資料由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科提供。標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、標(biāo)準(zhǔn)條件存放,病例標(biāo)本包含腫瘤組織及癌旁組織兩部分。20例新鮮的肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織取自遼寧省腫瘤醫(yī)院。術(shù)中立即從原發(fā)腫瘤及周圍正常肺組織中取直徑約5-8mm組織塊,立即放入液氮中,隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A-1、人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞

5、肺癌細(xì)胞系95D及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446購于中科院上海細(xì)胞研究所;Hela細(xì)胞系由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室惠贈。
　　 2、免疫組織化學(xué)RhoGDI2一抗(濃度為1:100稀釋),陰性對照加PBS緩沖液,4℃冰箱內(nèi)過夜。結(jié)果判斷按Shimizu方法[7],對每張切片陽性細(xì)胞的陽性強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別打0、1、2、3分,著色陽性面積按無著色、著色＜1/3、1/3～2/3、＞2/3分別打0、1、2、3

6、分,然后根據(jù)兩項打分之和判斷其結(jié)果,分?jǐn)?shù)＞3分為陽性。
　　 3、RT-PCR采用Trizol試劑提取肺癌組織中或培養(yǎng)細(xì)胞中的總RNA,利用RNA PCR Kit(AMV)試劑盒進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 4、細(xì)胞培養(yǎng)和分組
　　 人肺癌細(xì)胞系均生長于含10％胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基中,內(nèi)加100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,置于37℃、5％CO2、飽和

7、濕度條件下培養(yǎng),2～3 d傳代一次。細(xì)胞呈貼壁生長。
　　 rhHGF處理組:10ng/ml組;30 ng/ml組。
　　 LY294002處理組:5μmol/l組;20μmol/l組;50μmol/l組。
　　 Rapamycin處理組:10nmol/l組;20 nmol/l組;40 nmol/l組。
　　 聯(lián)合處理組:LY5μmol/l+R10nmol/1組;LY10μmol/l+R10nmol/l組

8、
　　 5、免疫熒光制備細(xì)胞爬片,4％多聚甲醛室溫下固定20 min,加入RhoGDI2一抗(1:100)濕盒4℃過夜,避光加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗,37℃孵育30 min,使用熒光顯微鏡觀察成像。
　　 6、Western Blot將含50μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,配制一抗稀釋液RhoGDI2(1:200),GAPDH(1:12000),將條帶用TTBS略加清洗后分別放

9、入一抗稀釋液中,搖床上室溫雜交2h,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1:5000)搖床上室溫雜交1 h后,ECL法顯色。
　　 7、細(xì)胞增殖測定實驗采用MTT法,取對數(shù)生長期的95D細(xì)胞接種于無菌的96孔培養(yǎng)板。實驗組分別加入不同的處理因素,繼續(xù)培養(yǎng),加入MTT(5g/L)20μl,放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入150μl的二甲基亞砜(DMSO),震蕩15 min,用全自動酶標(biāo)儀檢測490nm處的各孔吸光光度值(OD值)。以處理

10、因素量為橫坐標(biāo),相對增殖細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　 8、傷口愈合實驗將95D細(xì)胞懸液加入6孔板,37℃、5％CO2培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞貼壁。用10μL槍頭在孔中劃一直線后,用PBS液再沖洗2次;加入含不同濃度處理因素,以等量無藥培養(yǎng)液為對照,37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)每2小時觀察1次,直至劃痕被細(xì)胞填滿。
　　 9、侵襲實驗
　　 Matrigel膠用4℃培養(yǎng)液稀釋(1:3),在上室中每室加入200μ

11、l細(xì)胞懸液(4×105個細(xì)胞),下室中加入500μl含20％FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液;37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)24 h后,用棉簽擦去Matrigel膠和上層膜面細(xì)胞,無水乙醇固定30min,結(jié)晶紫染色5 min,光鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞,每膜計算5個視野,取均值。
　　 10、統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、RhoGDI2在人肺癌組織中的表達(dá)

12、r>　　 (1)免疫組化方法顯示RhoGDI2蛋白在多數(shù)肺癌組織中表達(dá)低于相對應(yīng)的癌旁正常肺組織。肺鱗癌的陽性表達(dá)略高于腺癌的表達(dá),但是兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.261);高中分化組陽性率高于低分化組,有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);TNM分期Ⅰ-Ⅱ期組陽性率高于Ⅲ-Ⅳ期組陽性率,兩者具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,兩者具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。RhoGDI2蛋白陽

13、性表達(dá)率與性別和年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　 (2)RT-PCR方法顯示RhoGDI2 mRNA在多數(shù)肺癌組織中表達(dá)也低于相對應(yīng)的癌旁正常肺組織。
　　 2、RhoGDI2在不同類型肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)在選取的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、95D、SPC-A-1和NCI-H446中,無論mRNA水平還是蛋白水平RhoGDI2都有表達(dá),但表達(dá)水平不盡相同;通過免疫熒光證實RhoGDI2蛋白主要表達(dá)在胞漿,細(xì)胞核有少量表達(dá)。

14、　　 3、RhoGDI2與PI3K/Akt/mTOR信號通路關(guān)系研究
　　 (1)HGF促進(jìn)95D細(xì)胞的增殖,運動遷移和侵襲;而較低濃度PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑Rapamycin就能抑制95D細(xì)胞的增殖,運動遷移和侵襲,聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)這一作用。
　　 (2)無血清培養(yǎng)的95D細(xì)胞中RhoGDI2蛋白的表達(dá),高于正常10％胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組,而10％胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組與10ng/ml rhH

15、GF組RhoGDI2蛋白的表達(dá)水平相當(dāng),但30 ng/ml rhHGF組RhoGDI2蛋白表達(dá)明顯降低。PI3K抑制劑LY294002處理組RhoGDI2蛋白的表達(dá)量增加,且隨濃度增加RhoGDI2蛋白表達(dá)也增加。mTOR抑制劑Rapamycin組,在低濃度時增加RhoGDI2蛋白的表達(dá),但增大Rapamycin的濃度,RhoGDI2蛋白的表達(dá)反而降低。低濃度LY294002組和Rapamycin組聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增加RhoGDI2蛋白

16、的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、無論mRNA水平還是蛋白水平,RhoGDI2在肺癌組織中的表達(dá)水平均低于相對應(yīng)的正常肺組織。RhoGDI2的表達(dá)與肺癌的組織分化、臨床分期和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),與組織類型,年齡和性別無關(guān)。
　　 2、RhoGDI2在肺癌細(xì)胞系中仍有低量表達(dá),這表明RhoGDI2下游信號通路可能已被阻斷,也更說明RhoGDI2在肺癌細(xì)胞系惡性生物學(xué)特性中受多種因子及信號通路調(diào)節(jié)。
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