SLIT2在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其主要來(lái)源于腺瘤。全球每年結(jié)直腸癌的新增病例超過(guò)100萬(wàn)人，其中約有一半患者因此而死亡。目前外科手術(shù)仍是治療結(jié)直腸癌最有效的方法，但是30％的患者在確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)期。對(duì)于不能手術(shù)的患者，目前采用的主要方法是化學(xué)治療、放射治療、有時(shí)結(jié)合局部微創(chuàng)的介入治療等。近年來(lái)隨著外科手術(shù)技能的提高及放化療手段的快速進(jìn)展，結(jié)直腸癌的療效得到了很大改善。但是，目前結(jié)直腸癌仍是世界范圍內(nèi)惡性腫

2、瘤患者死亡的主要原因之一，究其原因，主要是由于結(jié)直腸癌的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。
　　惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的表達(dá)增加或者抑癌基因的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，一些癌基因和抑癌基因的調(diào)節(jié)發(fā)生了異常，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。進(jìn)一步了解這些基因在腫瘤生物學(xué)中的作用機(jī)制，對(duì)于臨床治療效果的預(yù)測(cè)以及發(fā)現(xiàn)新的治療策略具有重要意義。神經(jīng)導(dǎo)向因子SLIT2基因位于第4p15.2號(hào)染色體，是一種分泌型糖蛋白，通過(guò)與其受體ROBO1結(jié)

3、合參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。一般情況下，SLIT2/ROBO1信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)控Rho-GTPases Rac1和cdc42的活性參與神經(jīng)元遷移調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道SLIT2在新生血管的形成中具有重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)SLIT2及其下游信號(hào)通路在多種腫瘤中均發(fā)生異常。在肝癌、宮頸癌、肺癌和乳腺癌中，SLIT2的表達(dá)量降低，這種由于啟動(dòng)子甲基化引起的表達(dá)抑制與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，SLIT2的表觀失活導(dǎo)致RhoGTPase的異常激活

4、，促進(jìn)腫瘤的遷移和浸潤(rùn)。另外，在纖維肉瘤和鱗狀細(xì)胞癌中，SLIT2能夠通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Cdk6以及其他與凋亡和增殖相關(guān)的基因的表達(dá)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　SLIT2表觀沉默與結(jié)直腸癌的異常生長(zhǎng)也有關(guān)系。大概72％的結(jié)直腸癌SLIT2啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了甲基化，并且在結(jié)直腸癌早期階段就存在SLIT2基因缺失。采用去甲基化試劑處理能夠使結(jié)直腸癌細(xì)胞中SLIT2的甲基化狀態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)正常表達(dá)。外源表達(dá)的SLIT2能夠抑制結(jié)直腸癌

5、細(xì)胞的克隆形成能力。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)ROBO1的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，增加SLIT2蛋白的表達(dá)量能夠募集泛素連接酶Hakai，引起E-cadherin泛素化和溶酶體降解，促進(jìn)上皮細(xì)胞一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，從而導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　以上的研究說(shuō)明，SLIT2在結(jié)直腸癌中的作用非常復(fù)雜。為了進(jìn)一步闡明SLIT2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，本研究中

6、，我們通過(guò)對(duì)臨床不同分期的結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析了SLIT2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特性之間的關(guān)系，并對(duì)SLIT2在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLIT2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展程度呈負(fù)相關(guān)，SLIT2蛋白的增加能夠減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞的遷移能力，而SLIT2基因的敲除則引起NCM細(xì)胞EMT的發(fā)生，并促進(jìn)細(xì)胞的侵襲遷移;進(jìn)一步的研究表明，SLIT2對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用受AKT-GSK3β信號(hào)通路的調(diào)控

7、。
　　第一部分 SLIT2表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系研究
　　目的:探索SLIT2的表達(dá)是否與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　方法:應(yīng)用q-PCR法檢測(cè)了SLIT2 mRNA，免疫組化法檢測(cè)了SLIT2蛋白和β-catenin蛋白在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況;
　　結(jié)果:SLIT2 mRNA在Duke C期和D期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯受到抑制;SLIT2蛋白和SLIT2受體蛋白R(shí)OBO1在轉(zhuǎn)移性結(jié)

8、直腸癌組織中的表達(dá)也顯著下調(diào);同時(shí)β-catenin在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)同步發(fā)生上調(diào)。
　　結(jié)論:SLIT2表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且可能有β-catenin的參與。
　　第二部分 SLIT2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用研究
　　目的:探索SLIT2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。
　　方法:利用結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞模型，通過(guò)添加外源SLIT2蛋白或轉(zhuǎn)染SLIT2表達(dá)質(zhì)粒使SLIT2在細(xì)

9、胞中過(guò)表達(dá)，或者采用RNAi的方法抑制SLIT2的表達(dá)，結(jié)合細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分析研究了SLIT2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響;
　　結(jié)果:細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，增加外源SLIT2蛋白能夠顯著降低SW480細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的速度，說(shuō)明其能夠抑制SW480細(xì)胞的能動(dòng)性。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將SLIT2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，使SLIT2在SW480細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同增加外源SLIT2一樣

10、，過(guò)表達(dá)SLIT2的SW480細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合速度明顯下降，說(shuō)明SLlT2對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響是通過(guò)細(xì)胞自主方式進(jìn)行的。通過(guò)RNAi的方法抑制NCM460細(xì)胞中SLIT2的表達(dá)后，細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的速度增快。同樣，Transwell分析顯示，SLIT2蛋白表達(dá)缺失后，NCM460細(xì)胞穿過(guò)基膜的數(shù)量明顯增加;而過(guò)表達(dá)SLIT2蛋白后，SW480細(xì)胞穿過(guò)基膜的數(shù)量顯著減少。
　　結(jié)論:SLIT2過(guò)表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移，而

11、表達(dá)缺失后結(jié)腸上皮細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，說(shuō)明SLIT2在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。
　　第三部分 SLIT2在結(jié)直腸癌上皮一細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究
　　目的:探索SLIT2在結(jié)直腸癌EMT過(guò)程中的作用。
　　方法:通過(guò)增加外源SLIT2或者RNAi抑制SLIT2表達(dá)構(gòu)建細(xì)胞模型，結(jié)合western blot和免疫熒光分析研究了SLIT2對(duì)EMT中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響;
　　結(jié)果:SW480細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)SLIT2

12、導(dǎo)致Snail表達(dá)下降，引起EMT過(guò)程中的關(guān)鍵分子E-cadherin的表達(dá)水平上調(diào)。NCM460細(xì)胞中，抑制SLIT2的表達(dá)后，Snail和β-catenin的表達(dá)增加，而E-cadherin表達(dá)則明顯下降;另外，SLIT2抑制后間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin的表達(dá)也發(fā)生上調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，NCM460細(xì)胞中SLlT2表達(dá)受到抑制后，大量β-catenin從細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　　結(jié)論:SL

13、IT2表達(dá)缺失能夠?qū)е陆Y(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　第四部分 SLIT2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)制研究目的:探討SLIT2引起結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移抑制的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:利用NCM460細(xì)胞株，通過(guò)RNAi抑制SLIT2的表達(dá)后用AKT抑制劑triciribine進(jìn)行處理，Transwell分析研究了AKT抑制對(duì)SLIT2缺失引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響;通過(guò)RNAi抑制SLIT2的表達(dá)后用AKT抑制劑tr

14、iciribine進(jìn)行處理，收集細(xì)胞蛋白western blot檢測(cè)p-AKT，p-GSK3β，Snail，E-cadherin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:Transwell分析顯示，AKT抑制劑處理后，SLIT2缺失引起的結(jié)腸上皮細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)受到抑制;在NCM460細(xì)胞中抑制SLIT2的表達(dá)后，p-AKT，p-GSK3β，Snail的表達(dá)水平上調(diào)，E-cadherin的表達(dá)下降;AKT抑制劑處理后，由于SLIT2缺失引起的上述