普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用研究.pdf

1、研究背景：
　　瘢痕疙瘩(keloid，KD)是皮膚損傷愈合過程中，成纖維細胞(Fibroblast)的膠原合成代謝持續(xù)處于亢進狀態(tài)，以致局部組織過度膠原纖維化的結(jié)果，稱為結(jié)締組織增生癥，在臨床上其又被稱為蟹足腫或巨痕癥[1]。其易發(fā)于前胸、后背、肩部、下頜、耳部及會陰部，具有生長迅速、浸潤正常組織的特性，伴瘙癢甚至疼痛，部分疙瘩表面可有破潰[2]。瘢痕疙瘩具有無自限性和極易復發(fā)的特性，不僅造成患者不同程度的瘙癢疼痛的不適，也因其

2、易發(fā)生于暴露部位，影響患者的形態(tài)美，給患者帶來的極大的心理負擔[3]。
　　瘢痕疙瘩的治療一直是臨床亟待解決的一大難題，特別是大面積的瘢痕疙瘩。作為皮膚纖維化疾病，成纖維細胞生長因子在瘢痕疙瘩形成的過程中具有重要作用。2010年，DE Mesquita CJ教授曾提出假想利用普萘洛爾對瘢痕疙瘩進行治療[4]。還有研究者發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾作為常用的β受體拮抗劑，具有抑制膠原蛋白的形成，具有抗纖維化的效果，其作用機理是通過競爭性抑制TGF

3、-β1受體，從而抑制了成纖維細胞的生物學活性，減少膠原的分泌，達到抗纖維化的效果[5]。同時普萘洛爾在治療血管瘤的侵襲性生長方面具有十分顯著的效果，其部分機理是抑制細胞生長因子的表達，從而達到抑制血管瘤的侵襲性生長[6-7]。基于此，我們開展了關(guān)于普萘洛爾(Propranolol，P)對瘢痕疙瘩成纖維細胞(Fibroblast of keloid，KF)的生物學特性影響的實驗研究。
　　目的：
　　1.對普萘洛爾作用后瘢痕疙

4、瘩成纖維細胞的生物學特性的變化進行研究，明確普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用機制。
　　2.為臨床應用普萘洛爾治療瘢痕疙瘩提供前期的研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.取經(jīng)病理結(jié)果證實的人瘢痕疙瘩組織，應用兩步酶消化法分離獲得瘢痕疙瘩成纖維細胞，貼壁培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　2.取傳代培養(yǎng)第三代，生長狀況良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞，利用免疫細胞化學技術(shù)，檢測間充質(zhì)干細胞表面標記物CD73、CD90和CD105

5、在瘢痕疙瘩成纖維細胞的表達情況，確定培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。
　　3.取傳代培養(yǎng)第三代，生長狀況良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞，經(jīng)50ng/L普萘洛爾的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組）和完全培養(yǎng)基（對照組）培養(yǎng)后，應用CCK-8檢測其生長特點，確定普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長能力的抑制作用。
　　4.取傳代培養(yǎng)第三代，生長狀況良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞，經(jīng)50ng/L普萘洛爾的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組）和完全培養(yǎng)基（對照組）培養(yǎng)48h后

6、，利用實時定量PCR技術(shù)(real-time RT-PCR技術(shù))對瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ/Ⅲ型膠原基因的進行檢測，確定普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的Ⅰ/Ⅲ型膠原基因的抑制作用。
　　5.取傳代培養(yǎng)第三代，生長狀況良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞，經(jīng)50ng/L普萘洛爾的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組）完全培養(yǎng)基（對照組）培養(yǎng)48h后，利用免疫蛋白印跡技術(shù)對瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ/Ⅲ型膠原的進行檢測，確定普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細胞的Ⅰ/Ⅲ型膠原分泌能

7、力的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞觀察其形態(tài)，細胞呈長梭形為主，排列規(guī)則，呈平行狀、放射狀、旋渦狀生長，免疫細胞化學技術(shù)對成纖維細胞的表面標記物進行鑒定，再次確定培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。
　　2.利用CCK-8檢測經(jīng)50ng/L普萘洛爾的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組）及完全培養(yǎng)基（對照組）培養(yǎng)后瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長能力，實驗組的瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖能力明顯受到抑制，與對照組相比，兩組生長能力

8、間差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);
　　3.real-time RT-PCR技術(shù)檢測Ⅰ型膠原基因和Ⅲ型膠原基因的表達情況，實驗組的瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ型膠原基因和Ⅲ型膠原基因表達受到抑制，與對照組相比較，兩組基因表達能力間差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);
　　4.Western Blot檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達情況，實驗組的瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌能力受到抑制，與對照組比較，兩組基因表達能力間差異