烏頭堿對心肌細(xì)胞DNA的損傷作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：烏頭(附子)是我國臨床常用的重要中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明烏頭及附子具有強(qiáng)心、升壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用。同時它具有很大毒性。烏頭堿既是烏頭(附子)的主要有效成分，又是主要毒性成分。目前，烏頭類中藥在文獻(xiàn)研究中廣泛報道的主要是心臟毒性(心律失常)和中樞神經(jīng)毒性方面的研究，而對遺傳毒性的研究很少。最新研究指出烏頭堿能導(dǎo)致心肌細(xì)胞DNA損傷，但其DNA損傷機(jī)制的研究尚未見報道。本課題采用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞從細(xì)胞內(nèi)的鈣超載和活性氧升高

2、的角度探討烏頭堿致DNA損傷的機(jī)制，將為闡明烏頭堿心肌毒性的分子機(jī)制及其合理用藥奠定理論基礎(chǔ)。 方法：在本研究中，利用免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度；采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)測定烏頭堿對原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞活力與藥物作用的量效和時效關(guān)系；利用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE法)-彗星試驗(yàn)法，檢測不同劑量的烏頭堿對心肌細(xì)胞DNA的損傷；機(jī)理研究中，利用流式細(xì)胞儀檢測烏頭堿對原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中的活性氧(ROS)與藥物作用的時效和

3、量效關(guān)系，并檢測抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和維生素E(VE)和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑釕紅(RR)預(yù)處理后烏頭堿對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響；并通過單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測抗氧化劑和鈣抑制劑預(yù)處理后烏頭堿對細(xì)胞的DNA損傷的影響。 結(jié)果：我們原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的純度達(dá)95％；烏頭堿導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力下降，具有一定的量效和時效關(guān)系，3μM烏頭堿作用60 min，心肌細(xì)胞活力為對照組的45％：烏頭堿導(dǎo)致心肌細(xì)胞DNA損傷，呈劑量依賴性，烏頭堿

4、各劑量組與空白組相比，尾部DNA百分含量和尾矩均有顯著差異；機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧明顯升高，具有一定的量效關(guān)系，3μM烏頭堿作用細(xì)胞不同時間后，胞內(nèi)的活性氧在90 min達(dá)到最大值；抗氧化劑NAC、VE和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑RR預(yù)處理后，能夠明顯減少烏頭堿誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加；抗氧化劑NAC、VE和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑RR預(yù)處理后，能夠明顯減弱烏頭堿誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞DNA損傷。 結(jié)論： 1、烏頭堿抑制