酵母催化不對稱還原2’-氯-苯乙酮及相關(guān)酶的克隆表達(dá).pdf

1、手性化合物由于其獨(dú)特的光學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域，隨著對不同光學(xué)異構(gòu)體藥物藥理作用的研究進(jìn)展和對外消旋藥物申報(bào)和使用的種種限制，手性藥物成為近年來研究的熱點(diǎn)和方向。光學(xué)純醇類化合物是手性藥物合成的重要中間體。利用微生物或其細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶催化潛手性酮的不對稱還原已成為制備高光學(xué)純度手性醇的重要方法。本文以2’-氯-苯乙酮作為模型底物，研究了水相中酵母全細(xì)胞催化芳香酮類化合物不對稱還原反應(yīng)的特性，并通過條件優(yōu)化提高

2、了反應(yīng)效率，強(qiáng)化了反應(yīng)過程。從酵母細(xì)胞內(nèi)分離純化出具有不對稱催化能力的氧化還原酶——羰基還原酶(CAR)，并通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了能有效表達(dá)羰基還原酶基因的重組大腸桿菌。在重組CAR不對稱還原2’-氯-苯乙酮的過程中，通過底物耦聯(lián)體系，成功地實(shí)現(xiàn)了輔酶NADH的原位再生。工作的主要內(nèi)容包括： (1)從實(shí)驗(yàn)室保存的七株酵母菌株中篩選出高效高選擇性還原2’-氯-苯乙酮為(S)-2’-氯-苯乙醇的酵母Candida pseudotr

3、opicalis 104(C.104)。研究了助溶劑乙醇含量對酵母還原產(chǎn)率的影響，比較了不同的水/有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)體系中的還原效率，最后選擇了無助溶劑的單一水相中酵母細(xì)胞催化還原高濃度2’-氯-苯乙酮作為反應(yīng)體系。不溶性底物在振蕩的狀態(tài)下呈微小液滴狀分散于緩沖液中。在加入20 g/L的葡萄糖作為輔助底物時(shí)，20 g<,DCW>(dry cell weight，細(xì)胞干重)/L的酵母可將19.48mmol/L的2’-氯-苯乙酮完全轉(zhuǎn)化，反應(yīng)

4、初速度達(dá)到33.27 mmol/(h·g<,DCW>)，反應(yīng)體系中的b/s(生物催化劑與底物質(zhì)量之比：酵母細(xì)胞干重g<,DCW>/底物質(zhì)量g)值為6.7。酵母細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)可耐受高達(dá)233.8 mmol/L(約36g/L)的底物濃度，反應(yīng)24小時(shí)產(chǎn)物濃度可達(dá)58.4 mmol/L。24小時(shí)以后，高濃度的底物和產(chǎn)物均會(huì)令酵母細(xì)胞失去活性甚至死亡。但在較低底物濃度(6.49 mmol/L)條件下，酵母細(xì)胞的耐受性提高，可以多次重復(fù)使用，使用

5、16次以后產(chǎn)率仍能達(dá)到100％。 (2)對酵母細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎，提取出粗酶液，經(jīng)過DEAE離子交換層析和Blue sepharose藍(lán)色瓊脂糖親和層析分離后，獲得了電泳純的的羰基還原酶(CAR)。最終酶活回收達(dá)到22.4％，比活力為15.8 U/mgPr，純化倍數(shù)為2980倍。純化的CAR表現(xiàn)出了比酵母細(xì)胞更高的催化選擇性，產(chǎn)物S構(gòu)型2’-氯-苯乙醇的對映體過剩(e．e.)值達(dá)到100％。 (3)對純化的羰基還原酶的酶

6、學(xué)性質(zhì)作了研究，該酶以NAD(H)為輔酶，可以不對稱催化酮的還原及相應(yīng)醇的氧化反應(yīng)。酶的最適溫度為50℃，催化氧化反應(yīng)的最適pH為8.5，催化還原反應(yīng)的最適pH在6.0到6.5之間。CAR的熱穩(wěn)定性較差，在30℃以上時(shí)酶蛋白迅速變性失活；酶蛋白對環(huán)境pH的變化比較敏感，僅在pH值7.0至8.5之間較為穩(wěn)定。多數(shù)金屬離子對酶催化具有抑制作用，EDTA的加入對酶活的影響不明顯。CAR具有廣泛的底物特異性，可以催化還原多種芳香族和脂肪族酮類化

7、合物，以及相應(yīng)醇類的氧化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果顯示，羰基還原酶對還原底物的活力大小受到羰基附近位阻效應(yīng)和電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的雙重影響，但以位阻效應(yīng)為主要影響因素。羰基還原酶對芳香酮類化合物具有很高的立體選擇性，對苯乙酮、2’-氯-苯乙酮、3’-氯-苯乙酮、4’-氯-苯乙酮、3-氯-1-苯丙酮和2-氯-2’，4’-二氟苯乙酮還原產(chǎn)物的e．e．值都達(dá)到100％，其反應(yīng)方式遵循Prelog反應(yīng)規(guī)則。 (4)從酵母C.104中成功擴(kuò)增得到CAR基因片斷，連接

8、到表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建得到重組菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CAR)。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，其比活達(dá)到0.24 U/mgPr，為酵母C.104(0.0053 U/mgpr)的40多倍。利用Ni-NTA Agarose親和層析，從重組菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CAR)中純化出了重組CAR，重組CAR與酵母細(xì)胞中分離出的CAR具有相同的酶學(xué)性質(zhì)。用相同的引物分別從酵母Saccharo

9、myces cerevisiae B5、Candida utilis 1257、Pichia membranaefaciens和Saccharomyces cerevisiae 4742中擴(kuò)增出與CAR基因序列相同的基因片段，說明CAR基因在多種酵母細(xì)胞中存在，具有高度的保守性。 (5)應(yīng)用重組CAR不對稱催化還原2’-氯-苯乙酮，通過加入異丙醇或仲丁醇作為輔助底物，建立了底物耦聯(lián)反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)輔酶NADH原位再生的反應(yīng)體系。對反