糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的比較蛋白質組學研究.pdf

1、利用雙向凝膠電泳分離視網(wǎng)膜蛋白質組中的蛋白點，并運用串聯(lián)質譜技術成功地鑒定出其中一些蛋白質。實驗結果證實，通過比較視網(wǎng)膜組織生理和病理狀態(tài)下2-D膠上蛋白質“點”的變化，分離表達差異有統(tǒng)計學意義的“點”進行質譜鑒定，可尋找與視網(wǎng)膜疾病相關的差異蛋白，為研究其發(fā)病機理、篩選藥物靶標以及臨床診斷和治療提供重要的理論與實驗依據(jù)。 目的： 1．建立并優(yōu)化大鼠視網(wǎng)膜蛋白質組分析所需的雙向凝膠電泳 (two-dimensioned

2、electrophoresis，2-DE)技術，以提高其分辨率及重復性。 2．觀察8周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及其蛋白質表達變化情況。 3．比較正常和 8 周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的蛋白質表達差異，運用串聯(lián)質譜鑒定差異蛋白點并進行生物信息學分析，初步揭示糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)發(fā)生中可能的分子病理機制。 方法： 1．用四氧嘧啶(Alloxan)腹腔內(nèi)注射健康雌性

3、 SD 大鼠構建糖尿病模型。八周后處死動物，立即取出眼球或視網(wǎng)膜用作組織切片、電鏡觀察或蛋白質組學分析。 2．對正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜做普通切片和超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察其組織病理變化特征。 3．從視網(wǎng)膜中提取蛋白質并純化和測定蛋白質濃度，經(jīng)固相pH梯度等電聚焦、平衡、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠染色和圖像掃描，建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜蛋白質表達譜。對影響2-DE結果的各種因素進行調整、優(yōu)化。

4、 4．用PDQuest 7.3.1軟件進行圖像剪切和優(yōu)化處理，以及點的檢測和計數(shù)，分析糖尿病性視網(wǎng)膜的蛋白質的差異表達情況。 5．對表達差異有統(tǒng)計學意義的蛋白質進行膠內(nèi)原位酶解和串聯(lián)質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)鑒定，所得結果用GPS-MASCOT進行數(shù)據(jù)庫檢索。 6．對鑒定出來的蛋白質進行生物信息學分析。 7．探討差異表達蛋白質在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變過程中的作用，以及它

5、們的臨床意義。 結果： 1．8周病程糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜光鏡結構和超微結構未見明顯改變。 2．成功獲得了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及正常視網(wǎng)膜組織蛋白質的雙向凝膠電泳圖譜，建立了穩(wěn)定的2-DE技術。 3．經(jīng)分析比較獲得 36 個表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)的蛋白質點，包括上調5個，下調23個，消失8個。 4．對其中8個差異表達的蛋白點進行質譜鑒定，其中表達上調的有晶狀體蛋白β A1(預測)(predi

6、cted crystallin beta A1)和晶狀體蛋白αB (Crystallin alpha B)，表達下調的有白蛋白 (albumin)、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2 (dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2，DDAH Ⅱ)、磷酸丙糖異構酶-1 (triosephosphate isomerase 1，’TIM-1)、ATP 合酶 d 鏈(ATPsynthase，H<'+>tran

7、sporting，mitochondrial FO complex,subunit d)和鳥苷酸激酶-1 (預測)(predicted guanylate kinase 1，GK-1)，表達消失的有過氧還原素6(Peroxiredoxin 6，Prdx 6)。 5．差異表達譜生物信息學分析結果顯示，作為小熱休克蛋白的晶狀體蛋白αB 為細胞保護的分子侶伴蛋白，在細胞骨架的保護和調節(jié)以及抗凋亡方面有重要作用。我們首次報道了它在糖尿病

8、視網(wǎng)膜組織中高表達，可能作為DR診治和預后的重要生化標記物。 白蛋白是哺乳動物脈管系統(tǒng)中最豐富的轉運和貯存蛋白，可調節(jié)血漿膠體滲透壓，增大血管內(nèi)徑，尤其是小動脈或毛細血管。它在抗氧化方面和NO信號轉導過程中有重要作用。在糖尿病視網(wǎng)膜組織中低表達的白蛋白可能影響到血漿膠體滲透壓和NO信號轉導，加重視網(wǎng)膜細胞死亡，最終導致失明。 二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(DDAH Ⅱ)能水解二甲基精氨酸(ADMA)和一甲基精氨酸(MM

9、A)，從而影響NO的產(chǎn)生，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中DDAH Ⅱ的下調能增加ADMA，降低NO合成，保護視網(wǎng)膜細胞免受高血糖的損傷。 磷酸丙糖異構酶-1(TIM-1)參與糖酵解，糖分解成丙酮酸鹽的反應鏈涉及到10種酶，其中TIM-1為第5種酶，能將DHAP轉化為GAP。高血糖能增加TIM-1．的硝化，導致TIM-1的低表達，從而減少了ATP的合成。TIM-1有可能作為DR診治的有用標記物。 鳥苷酸激酶-1(GK-1) 能催化AT

10、P依賴的GMP變成GDP，參與GMP循環(huán)，最終影響cGMP的水平，在視桿細胞的感光換能過程中起了重要作用。糖尿病視網(wǎng)膜組織中低表達的GK-1增加了GMP水平，使cGMP蓄積，最終影響到神經(jīng)沖動的產(chǎn)生，這有可能是DR致盲的一種可能機制。 ATP合酶d亞單位能催化合成ATP，但具體功能不清。糖網(wǎng)病視網(wǎng)膜中ATP合酶d亞單位的低表達會使ATP合成減少，影響到視網(wǎng)膜細胞的功能。過氧還原素6 (Prdx 6)是唯一同時具有GSH過氧化物酶

11、和磷脂酶A2活性的雙功能蛋白，能防止氧化應激。糖尿病視網(wǎng)膜中Prdx 6的消失可能會加重組織的氧化損傷。 晶狀體蛋白β A1與眼內(nèi)壓的增高有關，但在非晶狀體組織中的作用目前尚不清楚。 結論： 1．已建立的視網(wǎng)膜蛋白質2-DE技術將為進一步開展視網(wǎng)膜疾病的蛋白質組學研究奠定基礎。 2．8周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜未見明顯組織結構改變，但已經(jīng)有蛋白質表達的差異，提示糖尿病視網(wǎng)膜的蛋白質表達改變先于組織學改變。

12、 3．這些表達有差異的蛋白質，包括晶狀體蛋白αB、白蛋白、 DDAH II、TIM-1、GK-1、Prdx 6和ATP合酶d鏈等，在細胞骨架保護和調節(jié)、抗凋亡、抗氧化、NO信號轉導、感光換能作用、糖酵解、ATP合成、氧化應激等方面起著重要作用，可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制，有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和治療。 4．早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織學結構無明顯變化，但蛋白質表達出現(xiàn)較大的變化，涉及的蛋白質種類較多，與以往基因組研