水稻抗白葉枯病基因Xa26和Xa4的遺傳和功能分析.pdf

1、白葉枯病是水稻中重要的病害之一,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)于白葉枯病的防治主要利用抗病基因,水稻中鑒定了大量的抗白葉枯病基因,抗病基因的克隆將為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供抗源,同時(shí)對(duì)抗病基因功能的研究以及應(yīng)用這些抗病基因有著重要的指導(dǎo)意義。
　　 水稻抗白葉枯病基因Xa26和Xa4都定位于水稻11染色體長(zhǎng)臂的末端,Xa4是在中國(guó)水稻抗白葉枯病育種中應(yīng)用較廣的基因,Xa26是在三系雜交水稻恢復(fù)系明恢63中鑒定的廣譜抗病基因。采用圖位克隆的策略分離克隆這兩個(gè)基

2、因具有重大的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法對(duì)Xa4和Xa26的候選基因進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化,對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行接種鑒定,確定基因。首先將Xa26的兩個(gè)候選基因MRKa,MRKb,利用其自身啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化到粳稻感病品種牡丹江8中,接種發(fā)現(xiàn)所有攜帶MRKb的轉(zhuǎn)基因植株都獲得了對(duì)白葉枯病的抗性,對(duì)其T1代植株接種表明所有抗性和轉(zhuǎn)基因的表型共分離,說(shuō)明MRKb即為Xa26基因。牡丹江8背景的轉(zhuǎn)基因植株抗性相對(duì)于供體品種明恢63抗

3、性顯著提高,為了進(jìn)一步研究粳稻背景對(duì)Xa26抗性的影響,將Xa26導(dǎo)入到另外兩個(gè)感病的粳稻品種中花11和02428中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)背景下Xa26抗性也有明顯增強(qiáng),并且由成株期抗性變?yōu)槿诳剐?。以上結(jié)果表明粳稻背景有利于Xa26發(fā)揮功能。為了更深入地了解Xa26的功能,利用玉米泛素啟動(dòng)子在中花11和牡丹江8背景中超量表達(dá)Xa26,接種結(jié)果表明超量表達(dá)可以進(jìn)一步提高抗性,并可以在一定程度上拓寬抗譜,而對(duì)于水稻生長(zhǎng)發(fā)育并無(wú)明顯影響,預(yù)示

4、Xa26有著廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)我們還利用一個(gè)病原誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在相同背景下表達(dá)Xa26,轉(zhuǎn)基因植株的抗性明顯減弱。這表明Xa26介導(dǎo)的抗性受到遺傳背景和表達(dá)強(qiáng)度的影響。
　　 利用定量PCR的方法分析不同背景下不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株中Xa26的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)自身啟動(dòng)子調(diào)控Xa26的所有轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量都明顯高于兩個(gè)秈稻品種明恢63和IRBB3,這說(shuō)明Xa26在粳稻背景中的表達(dá)量明顯高于秈稻背景,表達(dá)量的升高可能是Xa26抗性增

5、強(qiáng)最直接的因?yàn)?。為了進(jìn)一步證明Xa26表達(dá)量與抗性的相關(guān)性,又在明恢63背景下超量表達(dá)Xa26,轉(zhuǎn)基因植株的抗性明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明Xa26發(fā)揮作用具有明顯的劑量效應(yīng)。
　　 Xa26在不同背景下在接種后的表達(dá)模式不同,在牡丹江背景轉(zhuǎn)基因植株中Xa26的表達(dá)有明顯的上升,而明恢63和IRBB3中卻有一個(gè)顯著的下降后再上升的趨勢(shì),但中花11背景的植株沒(méi)有明顯的變化。同時(shí)分析了Xa26在不同生育期的表達(dá)量的變化,發(fā)現(xiàn)Xa26在苗期

6、表達(dá)量較低,而隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)量逐步升高,在轉(zhuǎn)基因植株中也有相同的發(fā)現(xiàn),這個(gè)結(jié)果表明不同時(shí)期的表達(dá)量差異決定了不同時(shí)期的抗性差異。我們還發(fā)現(xiàn)Xa26的表達(dá)量的提高可以加快抗病反應(yīng)下游基因OsWRKY13和NH1對(duì)白葉枯病菌的應(yīng)答。這些結(jié)果說(shuō)明了Xa26基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)發(fā)育的影響,并且Xa26表達(dá)量的提高可以影響下游基因的表達(dá)。
　　 采用超量表達(dá)的方法研究了Xa26家族成員MRKa和MRKc的功能,在中花11中超量表達(dá)M

7、RKa,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為中等抗性；而MRKc的轉(zhuǎn)基因植株卻沒(méi)有獲得抗性,表明在抗病基因家族中一些成員會(huì)有抗性的殘留。構(gòu)建了一個(gè)MRKa和Xa26的嵌合基因:Xa26LRR-TM-MRKaK,可以介導(dǎo)對(duì)白葉枯病的部分抗性,這說(shuō)明通過(guò)人為的方法可以獲得新的抗病基因。同時(shí)對(duì)MRKa,Xa26,MRKc的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因的表達(dá)模式類(lèi)似,并且基因表達(dá)部位都集中在維管組織周?chē)?說(shuō)明抗病基因家族的表達(dá)模式在進(jìn)化上有一定的保守性。并且白葉枯病是

8、一個(gè)維管病害,抗病基因在維管周?chē)拇罅勘磉_(dá)有利于其更好的發(fā)揮作用。
　　 利用RNAi技術(shù)抑制明恢63中Xa26的表達(dá)后植株抗性下降,而轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育并沒(méi)有受到明顯影響,表明抗病可能是Xa26基因的主要功能。
　　 此外在Xa4的研究中,將候選基因B4-RKa,TQ-RKa,TQ-RKb,TQ-RKd轉(zhuǎn)化到幾個(gè)水稻品種中都沒(méi)有獲得抗性,表明這幾個(gè)基因都不是Xa4,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)還有一個(gè)基因可能是Xa4的候選基因:B