牛乳鐵蛋白活性肽在發(fā)光桿菌中的表達(dá)及其作用機(jī)理研究.pdf

1、本論文旨在研究一種新型抗菌肽——牛乳鐵蛋白活性肽（LfcinBA）在發(fā)光桿菌中的高效表達(dá)及其抗菌作用機(jī)理。 為達(dá)到此目的，本論文進(jìn)行了以下幾方面的研究： （1）從5 種發(fā)光桿菌菌株p. Luminescens DSM15138、DSM15139、DSM3368、DSM3369 和DSM12190 中篩選一種最佳LfcinBA 表達(dá)宿主菌； （2）在此發(fā)光桿菌中建立Red/ET 方法，并應(yīng)用此方法敲除發(fā)光桿菌中ci

2、pA 和cipB 基因，獲得發(fā)光桿菌突變株； （3）采用Red/ET方法構(gòu)建LfcinBA 融合表達(dá)質(zhì)粒pBAD-cipB-LfcinBA，實(shí)現(xiàn)其在發(fā)光桿菌突變株中的表達(dá)； （4）體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)LfcinBA 抗菌活性； （5）以21 日齡斷奶仔豬為動(dòng)物模型檢測(cè)LfcinBA 的抗菌促生長(zhǎng)功能，實(shí)驗(yàn)選用60 頭21 日齡健康二元雜（長(zhǎng)白×大約克）斷奶去勢(shì)仔豬（5.42±0.59kg），按隨機(jī)處理分為4 組：對(duì)照

3、組（CR），cipB 對(duì)照組（cipB），0.01％ LfcinBA 組（LfcinBA），0.01％硫酸粘桿菌素組（CLS），進(jìn)行為期21 天的飼養(yǎng)試驗(yàn)，研究LfcinBA 對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、免疫功能、抗氧化功能、腸道微生物區(qū)系以及小腸粘膜組織結(jié)構(gòu)的影響。 研究結(jié)果表明： （1）p. Luminescens DSM15138 的生長(zhǎng)速度、抗性和轉(zhuǎn)化率更符合作為L(zhǎng)fcinBA 表達(dá)宿主菌的要求，因此選擇p. L

4、uminescens DSM15138 作為宿主菌；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，p. Luminescens DSM15138 在培養(yǎng)3h 后，采用緩沖液（10％甘油+2mm HEPES）制備感受態(tài)細(xì)胞，在1100V/cm 電壓條件下轉(zhuǎn)化效果較好。 （2）在p. Luminescens DSM15138 中建立了Red/ET 重組方法，并應(yīng)用此方法敲除了DSM15138 中兩個(gè)晶體蛋白基因cipA 和cipB，得到LfcinBA 表達(dá)宿主菌命名為

5、p.luminescensTZR001。 （3）成功構(gòu)建了LfcinBA 表達(dá)質(zhì)粒pBAD-cipB-LfcinBA，并將其導(dǎo)入p. Luminescens TZR001 中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)表明LfcinBA表達(dá)量占總蛋白量的20％。 （4）體外抑菌試驗(yàn)表明LfcinBA 對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有極好的抗菌性能。 （5）以感染過(guò)大腸桿菌的21 日齡斷奶仔豬為動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)表明，與對(duì)照組

6、和cipB 組相比，LfcinBA 顯著提高斷奶仔豬平均日增重以及平均日采食量，而與抗生素組相比差異不顯著；LfcinBA組與對(duì)照組和cip 組相比，LfcinBA 組斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系以及腸道形態(tài)組織明顯得到改善，而同抗生素組相比，除空腸中大腸桿菌和乳酸桿菌以及回腸中雙歧桿菌數(shù)量較低外，LfcinBA 組斷奶仔豬腸道中大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌同抗生素組沒(méi)有顯著差異。 綜上所述，本研究首次在p. Luminescens