hWAPL基因在宮頸癌組織中的特異性表達(dá)及意義.pdf

1、目的與背景 宮頸癌是一種最常見的婦科惡性腫瘤，在婦女癌癥相關(guān)死亡原因中居第二位。近年來，隨著性傳播疾病的發(fā)病率逐年增加，宮頸癌的發(fā)病率有上升和年輕化趨勢。 hWAPL基因是一個近年來發(fā)現(xiàn)的宮頸癌特異性高表達(dá)基因，具有癌基因特性。hWAPL基因是果蠅WAPL基因在人體內(nèi)的同源序列，長約30 793bp，定位于10q23.2，編碼一種聚合錨定蛋白，可以在有絲分裂前期使染色體臂的聚合適時解離。其具體作用機(jī)制尚不甚明確，但其過度

2、表達(dá)，則會使得姐妹染色單體過早解離。 目前關(guān)于hWAPL基因在我國婦女宮頸癌組織中的表達(dá)情況尚未見報道，本課題研究hWAPL基因在中國婦女宮頸癌組織中的表達(dá)情況并探討其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其意義。 第一部分hWAPL基因蛋白表達(dá)水平檢測材料與方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)PV-9000對413例存檔石蠟切片進(jìn)行檢測。其中正常宮頸組織27例，宮頸癌47例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ 30例，CINⅡ 33例，CINⅢ 38例，胃

3、癌29例，肝癌28例，膀胱癌26例，食管癌35例，子宮內(nèi)膜癌25例，腎癌26例，直腸癌36例，肺癌33例。 采用顯色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比法判讀結(jié)果。以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，計3分；如現(xiàn)黃色顆粒，計2分；出顯淡黃色顆?；驘o黃色顆粒出現(xiàn)，分別計1分或0分。陽性細(xì)胞率6﹪～25﹪計1分，26﹪～50﹪計2分，51﹪～75﹪計3分，≥76﹪為4分。以染色強(qiáng)度分值與陽性細(xì)胞率分值的乘積作為最后得分，以積分≥3分為陽性表達(dá)病例。實(shí)驗數(shù)

4、據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。各組免疫積分之間利用單因素方差分析，各組陽性率之間利用x<'2>檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果正常宮頸組織僅在其基底部上皮細(xì)胞胞漿中偶可見少量淡黃色顆粒。隨著宮頸病變程度的加重，細(xì)胞染色強(qiáng)度逐漸加深，陽性染色細(xì)胞比例逐漸增加。宮頸癌組上皮全層細(xì)胞胞漿中均可見黃色或棕黃色顆粒。 hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、直腸癌、肺癌中組織細(xì)胞胞漿中無黃色顆粒或偶見散在淡黃色顆粒；在膀胱

5、癌和食管癌組織中，僅有部分樣本細(xì)胞胞漿中可見淡黃色顆粒。 hWAPL基因在宮頸癌組中免疫積分(x±s，6.49±2.54)顯著高于CINⅢ組(4.89±1.67)，P<0.001。CINⅢ組免疫積分顯著高于CINⅠ組(2.45±1.06)和CINⅡ(2.20±1.19)組，P均小于0.001。CINⅠ組和CINⅡ組免疫積分差異不顯著，P=0.553。CINⅠ組免疫積分顯著高于正常宮頸組(0.52±0.70)，P<0.001。

6、 正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌的hWAPL基因陽性表達(dá)率亦逐漸升高，分別為3.70﹪、40.00﹪、42.42﹪、89.47﹪和97.87﹪。宮頸癌和正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ組陽性表達(dá)率差異顯著(x<'2>=87.531，p<0.001)。 hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、直腸癌、肺癌中呈陰性表達(dá)；在膀胱癌和食管癌中，僅有部分樣本呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率分為11.54﹪和14.28﹪；在宮頸

7、癌陽性表達(dá)率則高達(dá)97.87﹪。 第二部分hWAPL基因mRNA表達(dá)量的分析材料與方法采用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測8例正常宮頸和11例宮頸癌新鮮組織中的mRNA表達(dá)情況。以β-actin基因為內(nèi)參。β-actin引物序列為5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’和5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3’。HWAPL基因引物為5’AATTGTCGAGCACTGATAGAG3’和5’ TTAAGTCAGCC

8、TCAAGTACCC3’。反應(yīng)條件為94℃，2min，預(yù)變性； 94℃，30s，變性；58℃，30s，復(fù)性；72℃，40s，延伸；共進(jìn)行35個循環(huán)。每個樣品做兩個平行，并設(shè)有兩個空白對照。反應(yīng)完成后，PCR擴(kuò)增儀電腦自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣本所有記錄點(diǎn)曲線，給出Ct值、擴(kuò)增曲線和目的基因拷貝數(shù)。樣本hWAPL基因mRNA拷貝數(shù)/內(nèi)參β-action基因mRNA拷貝數(shù)=hWAPL基因mRNA相對定量。實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)

9、行分析。兩組間hWAPL基因相對表達(dá)量比較利用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果正常宮頸組hWAPL基因相對表達(dá)量為1．81±0．58(x±s)，宮頸癌組hWAPL基因相對表達(dá)量為11．16±1．097。兩組間hWAPL基因。mRNA表達(dá)量存在顯著差異(T=21．838，P<0.001)。 結(jié)論 hWAPL基因是宮頸癌特異性高表達(dá)基因；隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變程度的加深，hWAPL基因表達(dá)量增高；宮頸癌組織中hWAPL基因mR