夏枯草對腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景和目的:根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報告,2000年全球惡性腫瘤死亡例數(shù)已經(jīng)超過700萬,占全部死亡人數(shù)的12％,在發(fā)展中國家占人口總數(shù)的9％,在發(fā)達(dá)國家占21％。我國是發(fā)展中國家,惡性腫瘤占居民死亡原因的19％,居常見死亡原因的首位。目前,化學(xué)藥物治療是治療人體惡性腫瘤的重要手段,盡管不斷有新的化療藥物和化療方案推出,但腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥性仍是化療失敗的主要原因之一,也是腫瘤治療的一大難題。
　　多藥耐藥性

2、(multidrug resistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時,對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。MDR形成的機(jī)理非常復(fù)雜,腫瘤細(xì)胞可以通過不同途徑導(dǎo)致MDR產(chǎn)生,而一種MDR細(xì)胞可以同時存在多種抗藥性機(jī)制。根據(jù)美國惡性腫瘤協(xié)會估計(jì),每年惡性腫瘤患者約49萬例死亡,其中90％以上患者的死亡受到耐藥在不同程度上的影響。因此,探求MDR現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制及尋求腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑或逆轉(zhuǎn)方法已經(jīng)成為國內(nèi)

3、外的研究的熱點(diǎn)。近年來,研究比較多的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米(verapamil,VER)等及反義RNA技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)、核酶技術(shù)以及基因敲除術(shù)為主導(dǎo)的基因逆轉(zhuǎn)方法或因大劑量造成的明顯的毒副作用,或因高成本、高技術(shù)難度,都使他們在臨床應(yīng)用上受到限制。作為我國國粹的中草藥,治療腫瘤的歷史十分久遠(yuǎn),因其具備“廉價、毒性小、安全范圍大、廣譜性強(qiáng)、作用靶點(diǎn)多”等作為耐藥腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的諸多優(yōu)勢,加之很多中草藥復(fù)方或單體本身就有一定的抗腫瘤作用,

4、所以在耐藥性腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的研究中,受到越來越廣泛的關(guān)注。近年來文獻(xiàn)報告已經(jīng)證實(shí),中藥具有逆轉(zhuǎn)MDR的生物活性成分:如黃酮類化合物、漢防已甲素、人參皂甙、雄黃、欖香烯以及某些中藥復(fù)方都具有體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用。因此,中藥在篩選MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究中具有很廣闊的應(yīng)用前景。夏枯草(Prunella vulgaris,PV)為唇形科PV屬植物PV的干燥成熟果穗,具有清火明目、軟堅(jiān)散結(jié)之功效,其對多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用,但PV在逆轉(zhuǎn)多

5、藥耐藥方面的研究鮮有報道。中國醫(yī)科大學(xué)2006屆碩士研究生周新穎的研究證實(shí)了PV可部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥,但對人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s及人肝癌細(xì)胞SMMC-7721耐藥的逆轉(zhuǎn)尚未見報道。本研究運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)觀察非毒性細(xì)胞劑量下不同濃度的PV對Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)的影響,探討可能存在的耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制,以

6、期找到具有臨床應(yīng)用前景的耐藥逆轉(zhuǎn)治療藥物。
　　方法:1、MTT法測定阿霉素(ADM)單用和PV與不同濃度梯度ADM聯(lián)合應(yīng)用對Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)。2、運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測非細(xì)胞毒性劑量下不同濃度的PV對Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞mdr1基因表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：1、PV對Raji細(xì)胞、MD

7、A-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性。通過劑量效應(yīng)曲線可確定PV的非細(xì)胞毒性劑量(生長率>95％)分別為10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml,PV對三種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50分別為31.67±0.89μg/ml、63.03±1.22μg/ml、81.45±2.16μg/ml。ADM對三種腫瘤細(xì)胞的IC50分別為1.28±0.66μg/ml、1.87±0.85μg/ml、2.

8、39±1.58μg/ml,選用非細(xì)胞毒性劑量濃度的PV與不同濃度的ADM聯(lián)合應(yīng)用,其對三種腫瘤細(xì)胞的IC50分別下降為0.77±0.35μg/ml、1.38±0.84μg/ml、1.96±1.19μg/ml。從結(jié)果中可以看出,PV與ADM共同作用于腫瘤細(xì)胞時,ADM的IC50值與ADM單獨(dú)作用于腫瘤細(xì)胞時相比結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05)。2、PV對腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因mdr1基因的影響,從電泳圖上可以看出,Raji細(xì)胞、MDA-M

9、B-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞均有mdr1基因的表達(dá),且SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng),MDA-MB-435s細(xì)胞表達(dá)居中,Raji細(xì)胞表達(dá)最弱,這與臨床上三種腫瘤的耐藥性程度相一致。并且經(jīng)過非毒性細(xì)胞劑量下不同濃度的PV處理的Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的mdr1基因的表達(dá)要比對照組細(xì)胞的表達(dá)弱;隨著PV劑量的增加,對腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥基因mdr1基因的表達(dá)下調(diào)作用越明顯(P<0.05)。

10、
　　結(jié)論：1、PV能抑制Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的增殖,抑制作用呈明顯的劑量依賴性。2、PV可逆轉(zhuǎn)Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞對ADM的耐藥性。3、Raji細(xì)胞、MDA-MB-435s細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞存在原發(fā)多藥耐藥性,mdr1基因的過表達(dá)可能是三種腫瘤細(xì)胞MDR形成的分子基礎(chǔ)之一。4、在非細(xì)胞毒性劑量下不同濃度的PV通過調(diào)節(jié)mdr1基因的表