K562及其耐藥株K562-A02細(xì)胞膜蛋白與耐藥機(jī)理的研究.pdf

1、細(xì)胞膜(Cell membrane)是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境交流的界面，也是細(xì)胞與周圍環(huán)境以及細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。細(xì)胞膜表面蛋白是細(xì)胞膜的重要組成部分，它們參與了細(xì)胞的識(shí)別和免疫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)及能量的傳遞等重要功能，對(duì)細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、分裂和分化都至關(guān)重要。
　　 細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平以及修飾情況，進(jìn)而了解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用、離子及溶液傳遞規(guī)律

2、等，同時(shí)也能為疫苗、病理研究等臨床應(yīng)用領(lǐng)域提供新的理論基礎(chǔ)。細(xì)胞膜蛋白質(zhì)在臨床藥物研究和開(kāi)發(fā)中占整個(gè)已知藥物靶標(biāo)的70％，而細(xì)胞膜的功能基本上都是由占細(xì)胞總蛋白質(zhì)20％～25％的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)來(lái)執(zhí)行的。
　　 膜蛋白具有疏水性強(qiáng)、相對(duì)豐度較低等特點(diǎn)，同時(shí)多數(shù)的膜蛋白存在著各種各樣的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、甲基化等，造成其具有不均一性。因此，分離和鑒定膜蛋白一直是膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究的難點(diǎn)。本研究利用生物素標(biāo)記的方法，通過(guò)使用一種

3、新型的納米乳膠顆粒材料Latex作為親和素的載體，在活細(xì)胞狀態(tài)下，進(jìn)行標(biāo)記、分離和提純。納米級(jí)顆粒的使用，在相同總體積的情況下，較通常使用的微米級(jí)或是毫米級(jí)顆粒大幅提高了載體的表面積，增加了親和素的結(jié)合量，同時(shí)摒棄了長(zhǎng)時(shí)間超速離心法的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，提高了分離純化效率。我們運(yùn)用該材料并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化后應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞、人和小鼠胚胎干細(xì)胞以及人類精子的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究上，都充分證明其高效性。以腫瘤細(xì)胞K562及其耐藥株K562/A02細(xì)胞為例，

4、我們運(yùn)用該方法共檢測(cè)到1294和1415種蛋白，其中膜及相關(guān)蛋白分別為645和726種，是目前已有報(bào)道中一次性檢測(cè)到該細(xì)胞膜蛋白最多的方法。與此同時(shí)，我們還首次在K562中發(fā)現(xiàn)了8種腫瘤標(biāo)志蛋白以及大量的低豐度、未知的和功能不明確的蛋白，體現(xiàn)了該方法的高靈敏度，且親水、疏水蛋白均可的廣泛適用性，為今后對(duì)細(xì)胞膜表面蛋白的深入研究提供了良好的技術(shù)平臺(tái)和理論基礎(chǔ)。
　　 慢性髓細(xì)胞樣白血病(chronic myeloid leukem

5、ia，CML)，是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，年發(fā)病率維持在每10萬(wàn)人中有1-2例。K562細(xì)胞株是人類建立的第一株髓系白血病細(xì)胞株，是目前公認(rèn)的最經(jīng)典的白血病研究模型之一，而K562/A02細(xì)胞株是用阿霉素（adriamycin，ADM）逐步篩選K562細(xì)胞所建立的一株具有典型多藥耐藥特征(multidrug resistance，MDR)細(xì)胞株。本文通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，對(duì)K562及其多藥耐藥株K562/A02細(xì)

6、胞質(zhì)膜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)層面的分離、鑒定及比較。僅K562細(xì)胞的膜蛋白中，我們就發(fā)現(xiàn)114個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，119個(gè)與代謝相關(guān)，95個(gè)與通道及運(yùn)輸有關(guān)，51個(gè)與囊泡運(yùn)輸有關(guān)，23個(gè)為粘附和連接蛋白，17個(gè)是氧化還原酶類，26個(gè)為伴侶分子，19個(gè)是與細(xì)胞骨架相關(guān)，17個(gè)與修飾作用有關(guān)，27個(gè)和蛋白降解有關(guān)，以及74個(gè)未知功能的膜相關(guān)蛋白，這是目前已知的對(duì)該細(xì)胞膜蛋白最完整、最全面的一次分類和總結(jié)。我們又經(jīng)過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了K

7、562/A02特異性的跨膜蛋白201種，也是已有報(bào)道中一次性發(fā)現(xiàn)K562/A02特異性跨膜蛋白最多的。這些研究結(jié)果都為尋找新的白血病耐藥相關(guān)蛋白提供了全新的研究方向。
　　 在對(duì)K562及其耐藥株K562/A02細(xì)胞膜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究的基礎(chǔ)上，我們就K562/A02特異性的膜表面分子--尼古丁型乙酰膽堿受體alpha3(nAChR a3)與該細(xì)胞耐藥性之間的關(guān)系進(jìn)行了深入的研究。我們發(fā)現(xiàn)，加入尼古丁后含有alpha3受體的