基于蛋白質(zhì)-DNA相互作用新型壓電生物傳感器的構(gòu)建.pdf

1、目的： 1.對白行研制的壓電石英生物傳感器檢測平臺進(jìn)行改進(jìn)。 2.用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)驗(yàn)證NF-кB順式元件(DNA)探針與特異性蛋白NF-кB的p65亞基和核蛋白的特異性結(jié)合。 3.建立基于蛋白質(zhì)-DNA相互作用的新型壓電生物傳感器及其影響因素探討，并優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件。 方法： 1.利用精細(xì)微加工法制作石英晶體，在其表

2、面光刻金膜電極，石英晶體AT切型、13×13mm、基頻10MHz、金膜電極直徑4.0mm，與檢測池組裝后形成傳感器檢測單元，傳感器檢測單元在檢測儀上構(gòu)成2×5型拔插式傳感器陣列。頻率記錄分析軟件從PESA-2.0升級到PESA-4.0，新軟件采用VisualC++語言設(shè)計(jì)，增加多項(xiàng)功能使其更適用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測的需要。對構(gòu)建好的壓電傳感器檢測平臺進(jìn)行氣液相穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及陣列檢測穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。 2.用EMSA驗(yàn)證NF-кB順式元件

3、(DNA)探針與特異性蛋白NF-кB的結(jié)合特異性。 3.將NF-кB順式元件(DNA)探針通過巰基化法固定在傳感器的金膜表面，并與特異性蛋白NF-кB的p65亞基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，通過計(jì)算機(jī)采集分析傳感器頻率數(shù)據(jù)，比較不同探針濃度、不同pH值、不同離子濃度下頻率的變化，經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行單因素分析選擇最佳反應(yīng)條件。 4.以不同濃度p65蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制p65檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對核蛋白提取物進(jìn)行檢測。同時(shí)，通過更換不同序列的巰

4、基化探針，探討傳感器檢測的特異性。 結(jié)果： 1.AT切型石英晶體液相起振能力強(qiáng)、頻率穩(wěn)定適合壓電生物傳感器檢測要求，傳感器組裝后，氣、液相檢測穩(wěn)定性好，調(diào)穩(wěn)后10分鐘內(nèi)氣相頻率變化不超過±1Hz、液相不超過±2Hz。 2.為了滿足臨床檢測的需要，新編PESA-4.0軟件增加了如病人信息錄入、歷史結(jié)果查閱、曲線擬合、定標(biāo)等多項(xiàng)功能，其中頻率自動更新和圖像編輯等功能的添加對實(shí)驗(yàn)室研究也有較大幫助。 3.EMS

5、A電泳結(jié)果顯示標(biāo)記了同位素的探針與NF-кB的p65亞基和核蛋白提取物的結(jié)合較空白對照產(chǎn)生了滯后的電泳條帶，說明了探針和蛋白結(jié)合的特異性。樣品空白泳道未加入蛋白固沒有特異性結(jié)合條帶。 4.運(yùn)用構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器檢測p65標(biāo)準(zhǔn)蛋白，探針固定濃度為2.0μmol/L，pH值為7.5，MgCl2離子強(qiáng)度為50mmol/L時(shí)結(jié)合反應(yīng)條件最佳。并確定結(jié)合反應(yīng)最終反應(yīng)時(shí)間為15min。 5.壓電生物傳感器對不同濃度p65進(jìn)行檢

6、測，在10-40ng/μl濃度范圍p65濃度與頻率下降呈線性相關(guān)，同時(shí)對傳感器的非特異性響應(yīng)信號進(jìn)行檢測，非特異性信號響應(yīng)小，不超過同濃度特異性信號的5％。 結(jié)論： 1.構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器檢測系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)較完善，工作穩(wěn)定，軟件穩(wěn)定易用，功能較完善，整個(gè)檢測系統(tǒng)可以應(yīng)用于檢測和研究。為臨床檢測開發(fā)的PESA-4.0分析軟件對實(shí)驗(yàn)研究也有較大幫助。 2.壓電傳感器檢測取得了較好的結(jié)果，檢測時(shí)間確定為15min，