Bortezomib對(duì)非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、肺癌是目前全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,近20多年的追蹤發(fā)現(xiàn),每年的肺癌新病例以大約0.5％的速率在增長(zhǎng),其死亡率位居惡性腫瘤之首,嚴(yán)重危害人類的生命及健康。衛(wèi)生部第三次全國(guó)死因調(diào)查顯示,肺癌為我國(guó)首位惡性腫瘤死亡的因?yàn)椤Ｆ渲蟹切〖?xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)是指除了小細(xì)胞癌以外的所有類型的肺癌,占所有肺癌的75％-80％。此類肺癌的治療多采用以手術(shù)治療為主的治療方法。由于早期臨床癥狀多數(shù)不甚

2、明顯,70％以上的病人在就診時(shí)已經(jīng)處于臨床晚期,而且多發(fā)生了淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移,往往已經(jīng)失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。盡管隨著診療水平的不斷提高,非小細(xì)胞肺癌的生存有所改善,但總的來(lái)說(shuō)預(yù)后仍然很差,中位生存期不到一年。非小細(xì)胞肺癌的一線化療有效率約為20％-35％,二線化療的有效率通常小于10％。用于非小細(xì)胞肺癌的多種治療方案最多使中位生存期延長(zhǎng)2-4個(gè)月。隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)的進(jìn)展和對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究,腫瘤治療進(jìn)入了分子靶向治療時(shí)代。

3、新一代分子靶向藥物蛋白酶體抑制劑Bortezomib(硼替佐米,商品名:萬(wàn)珂)已分別于2003年和2005年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的治療,通過(guò)抑制泛素蛋白酶體通路中NF-κB的活性發(fā)揮抗腫瘤作用。但是,Bortezomib在肺癌中的作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)還鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Bortezomib對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性的影響,探討其在肺癌中的抗腫瘤機(jī)

4、制。材料與方法
　　 1材料來(lái)源
　　 Bortezomib購(gòu)自西安楊森生物制藥有限公司?？剐∈驨F-κB、抗兔IκBa、抗山羊Bcl-2、抗兔p-Tublin和抗兔β-Actin的一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司?？故蟆⒖股窖蚝涂雇玫睦备^(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。GLC82、95D、H520、A549、973、H12996個(gè)NSCLC細(xì)胞系均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。Weste

5、rn blot中提取細(xì)胞總蛋白的細(xì)胞裂解液由本實(shí)驗(yàn)室提供。提取細(xì)胞核漿蛋白的試劑盒NE-PER Nuclear and CytoplasticExtraction Reagents購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。
　　 2試驗(yàn)方法
　　 (1)MTT法檢測(cè)Bortezomib對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
　　 細(xì)胞分4組:對(duì)照組(以無(wú)Bortezomib處理的正常培養(yǎng)細(xì)胞),25nmol/L組、50nmol/L組、100nmo

6、l/L組,分別采用25、50、100nmol/LBortezomib作用48小時(shí),MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。
　　 (2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bortezomib對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 取95D、973、GLC82細(xì)胞,均設(shè)為2組:25nmol/L組(采用25nmol/LBortezomib作用48h)和對(duì)照組(以無(wú)Bortezomib處理的正常培養(yǎng)細(xì)胞)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。
　　 (3)用

7、Western blot檢測(cè)不同濃度的Bortezomib作用不同時(shí)間對(duì)NSCLC細(xì)胞系中NF-κB的基本表達(dá)及活性的影響,同時(shí)檢測(cè)Bortezomib處理前后NSCLC中Bcl-2的表達(dá)情況。
　　 3結(jié)果
　　 (1)不同濃度Bortezomib對(duì)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的抑制作用
　　 Bortezomib對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有劑量依賴性,隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。
　　 (2)Bortezomib對(duì)

8、細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 25nmol/L的Bortezomib作用48小時(shí)(h)使NSCLC細(xì)胞系的細(xì)胞周期阻滯在了G2/M期,且處理后的處于G2/M期的細(xì)胞比例高于處理前,P<0.05。
　　 (3)Bortezomib對(duì)NF-κB表達(dá)的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示Bortezomib對(duì)組成性的NF-κB的表達(dá)水平?jīng)]有影響,但是能明顯地抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB的核轉(zhuǎn)位,并且這種抑制作用

9、具有劑量依賴性。
　　 (4)Bortezomib對(duì)973細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的影響
　　 作為973的對(duì)照細(xì)胞中存在抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。將細(xì)胞暴露于不同濃度的Bortezomib中處理后,可見(jiàn)Bcl-2的表達(dá)水平隨Bortezomib作用濃度的增加而降低。
　　 4結(jié)論
　　 Bortezomib能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系發(fā)生增殖,并使細(xì)胞發(fā)生G2/M期的阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時(shí)抑制NF-κ