生物傳感技術(shù)對活血化瘀中藥有效成分作用機理的研究.pdf

1、親和型生物傳感器以其靈敏度高、響應(yīng)快、特異性強、樣品無需標記等優(yōu)點越來越受到研究者的重視。本論文主要研究工作是通過不同的表面修飾技術(shù)，利用親和型生物傳感器構(gòu)建了可應(yīng)用于基于細胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作用機理研究的親和型生物傳感技術(shù)，并將其應(yīng)用于活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機理的研究中。論文的主要內(nèi)容概括如下： 1.可應(yīng)用于中藥有效成分作用機理研究的親和型生物傳感技術(shù)——IAsys和QCM生物傳感技術(shù)的構(gòu)建及其在赤

2、芍801作用機理研究中應(yīng)用的可行性和可信性。 利用生物素-親和素系統(tǒng)和自組裝膜技術(shù)，將sTNFR-I固定于IAsys樣品池和QCM基片表面，結(jié)合IAsys和QCM兩種親和型生物傳感器，檢測sTNFR-I與TNF-α的特異性相互作用，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了可應(yīng)用于基于細胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作用機理研究的親和型生物傳感技術(shù)。實驗結(jié)果表明：兩種方法均可有效地將sTNFR-I固定在傳感器的敏感表面上，而且sTNFR-I在樣品池表

3、面的固定化效果與sTNFR-I溶液濃度相關(guān)，12mg/L是sTNFR-I在IAsys樣品池和QCM基片表面固定化的最適濃度。TNF-α可與固定于IAsys樣品池和QCM基片表面的sTNFR-I發(fā)生特異性結(jié)合。重復(fù)性和可信性實驗表明：構(gòu)建的IAsys和QCM兩種親和型生物傳感技術(shù)在TNF-α與sTNFR-I特異性相互作用研究中的相對標準差(RSD)分別是2.12％和5.76％。證明該方法可以應(yīng)用于基于細胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作

4、用機理研究，而且具有很高的可行性和可信性。 2.IAsys和QCM生物傳感技術(shù)對活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機理的研究。 應(yīng)用構(gòu)建的IAsys和QCM兩種親和型生物傳感技術(shù)對TNF-α和sTNFR-I之間的特異性相互作用進行實時監(jiān)測，對TNF-α和sTNFR-I之間相互作用的動力學進行分析，并在此基礎(chǔ)上研究赤芍801、阿魏酸和川芎嗪對TNF-α和sTNFR-I相互作用的影響，以探討赤芍801的體內(nèi)靶點和作用機理。實

5、驗結(jié)果表明：TNF-α可與固定于樣品池表面的sTNFR-I發(fā)生濃度依賴性、特異性、快速結(jié)合，并經(jīng)FASTfit分析，計算反應(yīng)的動力學參數(shù)，親和常數(shù)KD=～10-7M，KA=～106M-1。赤芍801可增強其相互作用，增加TNF-α和sTNFR-I的親和力，使其相互作用的親和常數(shù)KD由～10-7M提高至～10-8M。并具有濃度依賴性。揭示了TNF-α與sTNFR-I的相互作用可能是赤芍801發(fā)揮其藥理學作用的體內(nèi)調(diào)控靶點之一。實驗結(jié)果還證

6、明：阿魏酸和川芎嗪對TNF-α和sTNFR-I之間的結(jié)合反應(yīng)無明顯影響。分別將應(yīng)用兩種不同的表面修飾技術(shù)構(gòu)建的IAsys和QCM生物傳感技術(shù)應(yīng)用于赤芍801作用機理的研究，不僅成功地完成了對TNF-α和sTNFR-I相互作用的實時監(jiān)測和動力學分析，且兩種方法取得了高度一致性的實驗結(jié)果，更進一步證實了該方法的科學性和可靠性。 對傳感器敏感表面的再生及使用壽命進行了研究，TNF-α結(jié)合至表面后可用10mMHCl洗脫其與sTNFR-I

7、的結(jié)合，再生得到sTNFR-I包被的樣品池表面，可重復(fù)使用。且生物素樣品池還可用飽和KOH洗脫其表面結(jié)合的全部蛋白，用于不用的實驗觀察。通過再生，樣品池可重復(fù)利用，降低成本。樣品池在包被配基后一周內(nèi)可保持較高的配體結(jié)合活性，可用于長期檢測。 3.IAsys和QCM生物傳感技術(shù)在活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機理研究中的比較 應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)和自組裝膜表面修飾技術(shù)均可有效將sTNFR-I固定于傳感器敏感表面以用于

8、與TNF-α的相互作用分析。且兩種修飾方法在傳感器敏感表面固定sTNFR-I的量，在sTNFR-I溶液濃度相同時差異很小。CMD樣品池由于不需要預(yù)先將sTNFR-I進行生物素標記處理等，從而簡化了操作。且能達到應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)同樣的固定sTNFR-I的效果。但由于通過CMD表面的羧基與蛋白的氨基鍵合而將蛋白質(zhì)配基固定于樣品池表面，以固定的配基難于在不破壞CMD表面的情況下徹底洗脫，因而不能再用于固定不同的配基；而生物素樣品池在使用

9、中由于配基蛋白質(zhì)不直接與樣品池表面結(jié)合，在一定條件下可以被洗脫。因此同一生物素樣品池可以重復(fù)利用，用于固定不用的配基蛋白。 在實際應(yīng)用中，QCM和IAsys均具有較高的重復(fù)性，QCM對144nMTNF-α與sTNFR-I的結(jié)合5次重復(fù)檢測的RSD=5.76％和8.56％，IAsys對144nMTNF-α與sTNFR-I的結(jié)合5次重復(fù)檢測的RSD=2.12％和1.49％，說明IAsys檢測的重復(fù)性優(yōu)于QCM。且由于檢測原理的不同，

10、IAsys檢測的響應(yīng)速度比QCM更快。 本研究以臨床常用及現(xiàn)代藥理學研究證實的有效的活血化瘀中藥有效成分赤芍801等作為切入點，應(yīng)用不同的表面修飾技術(shù)，結(jié)合IAsys和QCM生物傳感技術(shù)構(gòu)建了一種可應(yīng)用于基于TNF-α和sTNFR-I相互作用的中藥有效成分作用機理研究的簡單、快速、可靠的研究方法，并將其應(yīng)用于活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機理的研究中。不僅有助于闡明TNF-α/sTNFR-I的生物學意義和活血化瘀中藥有效成分