棉屬植物一鋅結(jié)合蛋白(ZnBP)基因的克隆、表達(dá)及功能初探.pdf

1、棉酚(Gossypol)不僅是棉屬植物體內(nèi)一種重要的抗性物質(zhì);也是醫(yī)藥上具有重要應(yīng)用價(jià)值的天然物質(zhì)，具有重要的男性抗生育、抗腫瘤、抗病毒等作用。為了有效調(diào)控這一重要的次生代謝產(chǎn)物，人們長(zhǎng)期致力于棉酚及其儲(chǔ)藏器官-色素腺體(Pigment gland)的研究。
　　從已構(gòu)建完成的棉花色素腺體形成時(shí)期的cDNA均一化文庫(kù)中篩選出一個(gè)棉花鋅結(jié)合蛋白(Zinc binding protein-ZnBP)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。經(jīng)過(guò)克隆，測(cè)

2、序及序列分析，發(fā)現(xiàn)該片段包含一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框，長(zhǎng)654個(gè)堿基，編碼217個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小為24.6kD，等電點(diǎn)為9.33。推導(dǎo)的氨基酸序列(EU372997.1)與擬南芥鋅結(jié)合蛋白(EFH46337.1)氨基酸序列同源性高達(dá)77％。以湘棉-18葉片基因組DNA為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增分離獲得棉花ZnBP基因的基因組序列。經(jīng)測(cè)序分析，得到1731bp的棉花gDNA片段，編碼區(qū)以ATG啟動(dòng)子開(kāi)始緊接著一個(gè)內(nèi)含子，其

3、中編碼區(qū)含有3個(gè)內(nèi)含子。以pET-28a(+)為原核表達(dá)載體，大腸桿菌BL21(DE3)為宿主表達(dá)菌，在37℃，IPTG終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間8h，轉(zhuǎn)速150r/min條件下，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)表達(dá);并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳及Western Blotting檢測(cè)分析表明蛋白表達(dá)正確。以pCAMBIA2300-35S-OCS為載體，構(gòu)建pCAMBIA2300-ZnBP超表達(dá)載體，并用凍融法轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌侵染法將Z