辛伐他汀對K562細胞作用及其機制的研究.pdf

1、目的：觀察辛伐他汀對K562細胞增殖和凋亡的影響，探討辛伐他汀抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡的分子機制。 方法：1．不同濃度辛伐他汀處理K562細胞24h，48h，72h，MTT法檢測細胞增殖情況。2．聯(lián)合應用AnnexinV．FITC／PI雙染法，光學顯微鏡和瓊脂糖凝膠電泳檢測辛伐他汀對K562細胞凋亡的影響，AnnexinV—FITC／PI雙染法檢測辛伐他汀聯(lián)合MIT對K562細胞凋亡的影響。辛伐他汀作用K562細胞24h

2、，流式細胞儀測定細胞周期。3．辛伐他汀處理K562細胞48h，免疫組織化學法測定突變P53，PCNA蛋白表達。4．辛伐他汀作用K562細胞48h，72h，利用分光光度法和PCR-ELISA法分別測定caspase-3,-9活性和端粒酶活性。5．辛伐他汀作用K562細胞72h，采用RT-PCR測定c-myc，c-jun，Bcl-2，Bax，survivin，cyclinDl，E2F1，MAPKl，hTERT,p21，p27mRNA的表達，

3、同時采用熒光定量RT-PCR檢測hTERTmRNA的表達。6．采用基因芯片技術檢測辛伐他汀作用K562細胞后的基因表達變化。 結(jié)果：1．辛伐他汀能抑制K562細胞增殖，其作用具有濃度和時間依賴性。2．AnnexinV—FITC／PI雙染法檢測結(jié)果顯示，5gmol／L，10gmol／L，20pmol／L辛伐他汀作用K562細胞48h能誘導其凋亡，細胞凋亡率分別為(4．00+0．13)％，(6．24+0．18)％和(9．41~0．2

4、2)％，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0．01)。5gmol／L，101amol／L，20gmol／L辛伐他汀作用K562細胞72h，細胞凋亡率分別為(7．62+0．21)％，(12．41+0．32)％和(19．08+0．26)％，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0．01)。10gmol／L，20gmol／L辛伐他汀作用K562細胞72h出現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)學改變，包括核固縮、核碎裂和凋亡小體形成等，同時DN

5、A凝膠電泳可見典型的DNALadder。0．25gmol／LMIT作用K562細胞72h細胞凋亡率為(16．38+0．20)％，而10~tmol／L辛伐他汀聯(lián)合0．25gmol／LMIT作用K562細胞72h細胞凋亡率為(36．92+0．67)％，辛伐他汀能增強MIT誘導的K562細胞凋亡。辛伐他汀作用K562細胞24h，G0/G1期細胞百分比增加，而S期細胞百分比減少，細胞阻滯于G1／S期。3．免疫組化結(jié)果表明辛伐他汀能抑制突變P53

6、和PCNA蛋白的過度表達，10ytmol／L，20gmol／L辛伐他汀處理K562細胞48h，突變P53和PCNA蛋白表達明顯下調(diào)，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0．01)。4.10~tmol／L，20~tmol／L辛伐他汀作用K562細胞48h，72h，caspase-3，一9活性明顯升高，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0．01)。PCR-ELISA結(jié)果顯示辛伐他汀對K562細胞端粒酶活性存在一定的抑制作用

7、，10gmol／L，201~mol／L辛伐他汀作用K562細胞72h使端粒酶活性分別下降14．44％和25．87％。5．10~tmol／L，20gmol／L辛伐他汀處理K562細胞72h，c-myc，cyclinDl，MAPKl，E2F1，Bcl-2，hTERTmRNA表達水平明顯降低，p21，p27，c-junmRNA表達水平顯著升高，而對Bax，survivin表達無明顯影響。同時定量RT-PCR結(jié)果進一步表明辛伐他汀能下調(diào)hTER

8、TmRNA表達。6．基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)20gmol／L辛伐他汀作用K562細胞48h，312條基因表達上調(diào)，212條基因表達下調(diào)，其中包括15條未知基因表達改變。根據(jù)基因功能分為代謝相關、凋亡相關、信號轉(zhuǎn)導相關和細胞周期相關基因等。 結(jié)論：1．辛伐他汀能抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡，其作用具有濃度和時間依賴性。2．辛伐他汀可能通過下調(diào)c-myc，cyclinDl，E2F1，MAPKl，Bcl-2mRNA和突變P53，PCNA蛋

9、白表達，上調(diào)p21，p27，c-junmRNA表達使K562細胞阻滯于Gl／S期，抑制細胞增殖并誘導其凋亡。3．辛伐他汀作用K562細胞引起hTERTmRNA表達下調(diào)，進而引起端粒酶活性下降。4．辛伐他汀可能通過激活caspase-9進而活化caspase-3誘導K562細胞凋亡。5．辛伐他汀引起K562細胞312條基因表達上調(diào)，212條基因表達下調(diào)，其中包括15條未知基因表達改變。 6．本研究較系統(tǒng)地探討了辛伐他汀的抗慢性粒細