NSC606985誘導(dǎo)U937細胞凋亡的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、急性髓細胞性白血病(acute myeloid 1eukemia，AML)是一種異質(zhì)性惡性血液腫瘤。過去二十年間，人們對于AML在生物學(xué)、分子和細胞遺傳學(xué)等方面的認識取得了巨大進展。與此同時，對于AML病人的治療也取得了長足進步。然而，大部分AML病人依然不可治愈。因此，開發(fā)新的藥物對于AML病人來說非常重要。作為一種新型的抗癌藥物，喜樹堿具有廣闊的發(fā)展前景。近兩年，宋滿根博士等在國際上首先研究了一種稱為NSC606985的新型喜樹堿衍

2、生物對白血病細胞的體內(nèi)外效應(yīng)。已有的實驗結(jié)果顯示，在體外，NSC606985能夠以極低濃度(納摩爾濃度水平)，通過水解激活PKC δ誘導(dǎo)急性早幼粒細胞性白血病NB4細胞和急性單核細胞性白血病U937細胞凋亡。 為了深入研究NSC606985誘導(dǎo)AML細胞凋亡的分子機制，本文用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析50nM NSC606985處理U937細胞36小時后差異表達的蛋白質(zhì)，結(jié)果確定有28種蛋白的表達發(fā)生改變。這些差異表達蛋白質(zhì)的功能涉

3、及細胞骨架、能量代謝、氧化應(yīng)激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA代謝、DNA代謝、蛋白質(zhì)代謝、分化、分子伴侶等。 骨架蛋白在這些差異表達的蛋白中占相當(dāng)?shù)谋壤?。本文用western b1ot和二維凝膠電泳+western blot的方法驗證骨架蛋白在二維凝膠電泳膠圖上的變化。這部分結(jié)果顯示：β-tubulin、β-actin和transgelin-2的總表達量沒有改變；對照組中，這些骨架蛋白有多個等電點，但經(jīng)NSC606985處理后(實驗組)，堿

4、性端的等電點都往酸性端偏移，實驗組中這些骨架蛋白只有一個等電點(相當(dāng)于對照組中最偏酸的等電點)；鑒于磷酸化修飾是最常見的翻譯后修飾，且能使等電點左移，推測這些骨架蛋白在NSC606985誘導(dǎo)U937細胞凋亡過程中發(fā)生磷酸化修飾；用堿性磷酸酶處理實驗組蛋白，后者有絕大部分往堿性端偏移，符合磷酸化蛋白的特點，證實經(jīng)NSC606985處理后，這三種蛋白發(fā)生磷酸化修飾；鑒于前期工作表明PKC δ水解激活在NSC606985誘導(dǎo)U937細胞凋亡過

5、程中的重要地位和這三種蛋白都具有PKC δ的識別模序(經(jīng)scansite分析軟件預(yù)測)，觀察PKC δ特異抑制劑rottlerin預(yù)處理是否能抑制NSC606985誘導(dǎo)的骨架蛋白磷酸化修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rottlerin能抑制β-tubulin和β-actin磷酸化，不能抑制transgelin-2磷酸化；提示β-tubulin和β-actin的磷酸化在PKC δ剪切活化的下游，而transgelin-2磷酸化不是PKCδ剪切活化的下游事件

6、。抗氧化蛋白peroxiredoxin 1和thioredoxin都明顯上調(diào)，提示活性氧生成增加。為明確活性氧在NSC606985誘導(dǎo)U937細胞凋亡過程中的變化、機制和意義，本文用DCF法檢測活性氧的含量；結(jié)果證實NSC606985處理24h，U937細胞活性氧增多；并且這種變化處于PKCδ剪切活化的下游，用rottlerin可抑制這種改變；NAC雖然能完全清除NSC606985作用下的U937細胞中增多的活性氧，卻對U937細胞的凋