天然腦活素的分子基因藥效學(xué)系列研究.pdf

1、為了闡明老年癡呆中藥科研制劑天然腦活素的分子基因藥效學(xué)機理,設(shè)計并實施了以下系列實驗。 1.探討天然腦活素對Aβ1-40致阿爾茨海默氏病(AD)細(xì)胞模型的神經(jīng)毒性的保護作用及其可能的分子機制。研究采用Aβ1-40處理PC12細(xì)胞復(fù)制AD細(xì)胞模型,不同劑量的天然腦活素孵育AD模型細(xì)胞,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞突起生長情況,計數(shù)陽性細(xì)胞率；MTT法檢測細(xì)胞增殖活度(AMTT值),免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白MAP-2的表達

2、,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax,Caspase-3)的表達水平。實驗發(fā)現(xiàn)：天然腦活素處理組細(xì)胞突起生長明顯,細(xì)胞增殖活度,胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白MAP-2的表達顯著高于AD模型組細(xì)胞(P<0.05 or P<0.01),細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達較模型組顯著上調(diào),同時細(xì)胞凋亡促進蛋白Bax及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白Caspase-3的表達明顯下調(diào)(P<0.05 or P<0.01)。結(jié)果提示：天然腦活素對Aβ1-

3、40致AD細(xì)胞模型的神經(jīng)毒性具有明顯的拮抗和改善作用,其機制可能與其在一定程度上促進細(xì)胞增殖、上調(diào)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白的表達、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的水平,抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)。 2.探討天然腦活素延緩人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)復(fù)制性衰老的作用及其分子機制。本實驗在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,繪制細(xì)胞生長曲線,MTT法檢測細(xì)胞增殖活度,SA-β-gal染色法觀察細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性的改變,計數(shù)陽性細(xì)胞率

4、；TRAP-ELISA法檢測細(xì)胞端粒酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)：天然腦活素孵育的MRC-5細(xì)胞老齡化不明顯,細(xì)胞增殖能力較空白老齡對照組明顯增加(P<0.05);天然腦活素連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞在老齡階段SA-β-gal陽性率均顯著低于老齡對照細(xì)胞(P<0.01);天然腦活素處理的細(xì)胞端粒酶活性較空白老齡對照組明顯上調(diào)(P<0.05)。表明：天然腦活素可能通過促進細(xì)胞增殖,激活細(xì)胞端粒酶的表達,降低SA-β-Gal酶活性,進而有效延緩細(xì)胞的復(fù)制性衰

5、老。 3.從分子基因水平，探討天然腦活素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用。選取6-8周齡SD大鼠,無菌獲取脛骨和股骨骨髓,全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)并純化大鼠MSC,應(yīng)用天然腦活素誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)元分化。倒置相差顯微鏡追蹤比較觀察分化過程中細(xì)胞形態(tài)的變化,免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR方法檢測神經(jīng)元特異性標(biāo)志物：巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況。免疫細(xì)

6、胞化學(xué)檢測細(xì)胞微管相關(guān)蛋白MAP-2的表達。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)全骨髓貼壁篩選法獲得了純度較高(90％以上)的大鼠MSC,天然腦活素誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞呈現(xiàn)雙極、多極和錐形的典型神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài),分別從mRNA和蛋白水平上證實誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表達神經(jīng)元標(biāo)記物NSE和Nestin,不表達神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP。誘導(dǎo)分化后細(xì)胞MAP-2的表達明顯。結(jié)果表明：天然腦活素可誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞的定向分化。 4.探討天然腦活素對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

7、(ER stress)損傷的保護作用,以期從分子基因水平闡明其抗AD作用的分子機理。以原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)為實驗對象,分別以衣霉素(Tm)和Aβ1-40誘導(dǎo)MSC模擬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,應(yīng)用RT-PCR、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot蛋白免疫印跡技術(shù)分別檢測幫助細(xì)胞抵制應(yīng)激損傷的保護性應(yīng)激蛋白-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和GRP94,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的促凋亡分子Caspase-12的mRNA和蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果

8、顯示:Tm或Aβ1-40干預(yù)MSC,細(xì)胞GRP78和GRP94及Caspase-12mRNA和蛋白質(zhì)的表達均明顯增高(P<0.05),模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型成功；分別同時予以天然腦活素處理后,MSC細(xì)胞GRP78和GRP94 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均明顯高于模型組細(xì)胞(P<0.05 or P<0.01),而Caspase-12 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均較模型組細(xì)胞顯著下調(diào)(P<0.05 or P<0.01),該作用與天然腦活素呈現(xiàn)一

9、定程度的濃度依賴性。表明：天然腦活素可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡,對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷具有明顯的保護作用。 5.探討天然腦活素對大鼠MSC和AD大鼠海馬組織基因表達譜的影響。原代培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),采用天然腦活素溫育細(xì)胞48h,Trizol法提取細(xì)胞總RNA,以正常培養(yǎng)的MSC細(xì)胞作對照,Affymetrix大鼠基因表達譜芯片分析天然腦活素處理組細(xì)胞基因表達譜的改變。另外,采用大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ1-40的方

10、法復(fù)制AD動物模型,同時予以天然腦活素灌胃治療30d,檢測大鼠腦組織與體重比,Trizol法提取海馬組織總RNA,Affymetrix大鼠表達譜基因芯片分析比較假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠海馬組織基因表達譜的變化。結(jié)果顯示：天然腦活素處理MSC細(xì)胞后,有18個基因表達明顯上調(diào)(FC>2);同時發(fā)現(xiàn)28個基因表達明顯下調(diào)(FC<-2)。動物實驗結(jié)果顯示,AD模型組海馬組織與體重比較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05),天然腦活素治療組海馬組織

11、與體重比較模型組顯著升高(P<0.05),與假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。基因芯片分析結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比對照,AD模型組海馬組織有58個差異明顯的基因上調(diào),25個差異顯著的基因下調(diào)。與模型組海馬組織對照,天然腦活素治療組海馬組織出現(xiàn)15個差異顯著的基因上調(diào),28個差異基因明顯下調(diào)。差異表達基因分別涉及包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化發(fā)育、粘附、神經(jīng)生長、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)/能量代謝、免疫應(yīng)答等方面。表明：天然腦活素可在多