6-BA和氮素調(diào)控小麥、棉花葉片衰老的生理機(jī)制及衰老相關(guān)基因鑒定.pdf

1、早衰是生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)生的限制作物光合潛力、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。深刻揭示與早衰相關(guān)的植物衰老的生理和分子機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步提高作物的光合生產(chǎn)力具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。本項(xiàng)研究在前人基礎(chǔ)上，研究了細(xì)胞分裂素類物質(zhì)(6-芐基嘌呤，6-BA)和氮素調(diào)控小麥、棉花葉片衰老的生理機(jī)制，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)小麥和棉花葉片自然衰老以及6-BA和氮素調(diào)控過程中的特異表達(dá)基因進(jìn)行了鑒定。采用基因克隆、表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，開展了可能與小麥衰老和

2、抗逆相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD)新型基因的克隆和功能研究。主要研究結(jié)果如下: 1.對(duì)6-BA調(diào)控小麥葉片衰老特征及其生理機(jī)制研究表明，與對(duì)照相比，噴施外源6-BA能維持小麥葉片衰老期間較高的葉綠素含量，增加葉片衰老后期的過氧化氫酶(CAT)活性，降低細(xì)胞的膜脂過氧化程度。上述機(jī)制是外源6-BA延緩植株和葉片衰老的重要生理原因。生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)小麥的熟期和葉片衰老特征，合理施用外源細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的濃度和數(shù)量。 2.低氮處

3、理小麥株高、單株葉面積、鮮重和干重均有不同程度的降低。葉綠素a、b、光合速率、可溶性糖和可溶性蛋白含量均明顯降低。不同供氮水平對(duì)細(xì)胞膜質(zhì)過氧化和葉片衰老程度的細(xì)胞保護(hù)酶的調(diào)控，主要是通過SOD活性和過氧化物酶(POD)活性共同調(diào)控完成的，CAT活性的調(diào)控效應(yīng)較小。研究表明，低氮處理中糖、氮代謝減慢，可能是葉片結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，進(jìn)而造成葉片衰老加快的主要原因之一。 3.采用cDNA-AFLP技術(shù)，在小麥自然衰老15d、30d和4

4、5d中，分別鑒定了9、20和16個(gè)特異上調(diào)表達(dá)基因；以及13、8和4個(gè)特異下調(diào)表達(dá)基因。利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)上述基因的比對(duì)和功能分組表明，上調(diào)基因歸屬于細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞防御和保護(hù)4個(gè)類別；下調(diào)基因歸屬于細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞防御和保護(hù)3個(gè)類別。6-BA處理后15d和30d，分別鑒定了13個(gè)和8個(gè)上調(diào)特異基因，2個(gè)和4個(gè)下調(diào)特異表達(dá)基因。上述基因分別歸屬于細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞防御和保護(hù)4個(gè)類別。低氮

5、處理15d后，分別鑒定了與對(duì)照相比特異上、下調(diào)特異表達(dá)基因?yàn)?3個(gè)和4個(gè)，歸屬于細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞防御和保護(hù)5個(gè)類別。結(jié)果表明，在小麥的自然衰老過程，以及外源6-BA和低氮處理調(diào)控的葉片衰老過程中，存在著復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑，小麥葉片衰老是通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的多條代謝途徑共同作用的結(jié)果。 4.與對(duì)照(CK)相比，外源6-BA增加了棉花的株高、主莖出生葉數(shù)、單株葉面積和單株干重。6-BA對(duì)葉綠素含量、

6、可溶蛋白含量和光合速率也有一定的促進(jìn)作用，但以對(duì)易衰型品種33B的促進(jìn)效應(yīng)較大，延衰型品種豐抗6的促進(jìn)效應(yīng)較小。6-BA處理使SOD活性和POD活性增加，丙二醛(MDA)含量降低。6-BA改善了葉片生長中后期活性氧產(chǎn)生和清除之間的平衡能力，可能是改善葉片光合、植株生長和延緩葉片衰老的重要內(nèi)在原因。外源施用6-BA，對(duì)于延緩生產(chǎn)中易衰型棉花品種的衰老可能具有重要作用。 5.以易衰型品種33B和延衰型品種豐抗6為材料，研究了不同氮素

7、水平對(duì)棉花光合和衰老特性的影響。研究表明，在不同氮素水平下豐抗6的光合速率(Pn)均明顯高于33B。隨著處理時(shí)間延長，不同氮素處理下33B和豐抗6的葉綠素a、b含量、類胡蘿卜素含量和可溶蛋白含量均不斷下降，其中，在低氮下，處理中后期豐抗6的上述參數(shù)高于33B。低氮處理下，與33B相比，豐抗6處理中后期具有較高的SOD活性。不同氮素處理中，豐抗6的MDA含量低于33B，而單株干重和單株葉面積則高于33B。較低的細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度可能是延衰

8、型品種豐抗6在不同氮素水平下衰老緩慢的重要生理基礎(chǔ)。 6.利用cDNA-AFLP技術(shù)，鑒定棉花葉片自然衰老15d和30d與葉片全展(展后0d)相比的特異表達(dá)基因。其中特異上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?3個(gè)和22個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因均為6個(gè)。分別歸屬于細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)命運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞防御和保護(hù)等6個(gè)類別。分析發(fā)現(xiàn)，衰老信號(hào)通過誘發(fā)Ca2+信號(hào)及其級(jí)聯(lián)傳遞，可能介導(dǎo)了棉花葉片的自然衰老進(jìn)程。6-BA處理后，在葉片衰老期間15d和

9、30d分別鑒定了12個(gè)和6個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，以及5個(gè)和14個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，分別歸屬于細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞防御和保護(hù)及細(xì)胞組分再生等7個(gè)類別。外源6-BA處理可能通過對(duì)生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，參與了對(duì)棉花葉片的衰老調(diào)控。本研究中，在低氮處理后15d和30d鑒定的特異上調(diào)表達(dá)基因分別為16個(gè)和10個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因分別為4個(gè)和20個(gè)。 7.依據(jù)在NCBI基因庫中發(fā)布的小麥CuZnSOD基因SOD1.1的

10、堿基序列，克隆了2個(gè)可能在植物抗逆和延緩衰老中具有重要功能的小麥新型SOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2。研究表明，TaSOD1.1和TaSOD1.2的全長cDNA序列分別為980bp和1121bp，均編碼201個(gè)氨基酸。編碼蛋白質(zhì)中含有一個(gè)79個(gè)氨基酸殘基組成的CuZn-SOD保守域和一個(gè)由45個(gè)氨基酸殘基組成的位于N-端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。研究發(fā)現(xiàn)，在葉片自然老化過程中，TaSOD1.1和TaSOD1.2的表達(dá)水平?jīng)]有改變；在干旱、鹽

11、分、低溫和高溫逆境條件下，TaSOD1.1珀勺表達(dá)水平也無變化；但TaSOD1.2的表達(dá)受到上述逆境的誘導(dǎo)。且TaSOD1.2在逆境下誘導(dǎo)表達(dá)水平的增加幅度與同期葉片SOD活性的增高幅度相一致。表明上述逆境信號(hào)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)TaSOD1.2基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 8.對(duì)超表達(dá)TaSOD1.1和TaSOD1.2的煙草轉(zhuǎn)基因系的延衰和抗逆功能研究表明，超表達(dá)上述基因的轉(zhuǎn)基因系，葉片衰老與對(duì)照相比沒有明顯的延緩。但超表達(dá)TaSOD1.1和T