肺炎克雷伯菌耐藥質粒的比較基因組學研究.pdf

1、我們用肺炎克雷伯菌一個70，057bp，GC含量為52.3％，含有95個ORF的環(huán)狀質粒pKF3-70與其他質粒進行了比較基因組學分析，發(fā)現(xiàn)pKF3-70可以分為5個主要的區(qū)域：①質粒不兼容分配系統(tǒng)；②質粒復制系統(tǒng)；③質粒接合系統(tǒng)；④質粒轉移前導區(qū)；⑤可變區(qū)。 比較基因組學分析揭示pKF3-70的復制系統(tǒng)，分配系統(tǒng)，接合系統(tǒng)，前導區(qū)都與大腸桿菌質粒R100高度相似，暗示pKF3-70的骨架序列，是從一個類似R100的質粒演化而來

2、。質粒pKF3-70復制區(qū)的必須元件包括一個149bp的復制起始位點(ori)，復制起始蛋白編碼基因repAl及其上游的負調節(jié)位點copA和copB(repA2)，pKF3-70復制區(qū)具有與FⅡ不兼容組R100(也稱NR1)的復制子區(qū)完全一致的序列，而且這個復制系統(tǒng)是pKF3-70上發(fā)現(xiàn)的唯一復制系統(tǒng)，這意味著pKF3-70，R100，R1具有一樣的復制機制，pKF3-70利用反義RNA的機制實現(xiàn)拷貝數(shù)控制，復制方式是具有theta模式

3、的單向復制；質粒pKF3-70的分配系統(tǒng)是一個長達1.56 kb的區(qū)域，它的組成元件包括：一段包含十個重復單元的正向重復序列(parC)，及其下游的ORF1和ORF2。這個區(qū)域與已知的IncFⅡ組質粒R1及R100的parA分配系統(tǒng)在序列十分相似，ORF1 and ORF2組成一個可以共轉錄的操縱子。ORF1 and ORF2編碼的蛋白分別是ParM和ParR，ParM具有ATP酶活性而 The ParR可結合到parC上并借此調節(jié)啟動

4、子活性。pKF3-70的復制和分配系統(tǒng)都與incFⅡ組的質粒R1和R100十分接近，暗示pKF3-70和這兩個質粒很可能是不兼容的。 pKF3-70接合起始區(qū)(OriT)包括切口(nick)位點及附近的接合轉移調節(jié)因子的結合位點。PKF3-70的OriT區(qū)分保守區(qū)和非保守區(qū)，非保守區(qū)主要是TraY蛋白的結合位點(sby)。該結合位點非保守性與TraY蛋白序列本身的非保守性有關聯(lián)，我們發(fā)現(xiàn)TraY只是前24個氨基酸殘基是非保守的

5、，因此很可能TraY與DNA結合的蛋白域就處于這前24個氨基酸殘基中。 我們發(fā)現(xiàn)3個類F質粒的接合轉移區(qū)幾乎一致，類F質粒與類W質粒接合系統(tǒng)間的進化距離較大的，但它仍比類F質粒和類P質粒間的距離顯得小。pKF3-70所有的推測基因都能在R100及F質粒上找到同源基因。有5個基因(traC，traG，traI，traD and traX)甚至在不同兼容組的質粒上也是保守的，這暗示它們可能參與質粒接合系統(tǒng)的基本構建。各個類F接合系統(tǒng)

6、之間比較分析顯示有六個預測基因在R100和pKF3-70中都是保守的，但在F質粒中卻不保守。ORF22是這六個預測基因中最長的ORF，編碼一個長達286 aa的假設蛋白。在它起始位點上游26bp的位置能預測到一個啟動子，用CD-search可以發(fā)現(xiàn)其序列有一個磷酸脂酶域，它可能與脂類代謝有關，但還需進一步的研究這個蛋白在質粒接合轉移過程當中所起的功能；PKF3-70的前導區(qū)長約17.5kb，含有35個預測基因。我們發(fā)現(xiàn)前導區(qū)包含一些與質

7、粒穩(wěn)定有關的基因比如一些DNA修飾基因及分離后殺滅基因。與F及R100質粒相比，pKF3-70擁有13個獨一無二的基因，它們在R100和F中不存在，其中ORF62可以預測到一個跨膜域，但具體功能未知。 質粒pKF3-70攜有耐藥基因ctx-m-14，ctx-m-14的上游是一個插入序列ISEcp1，ctx-m-14的下游是一個截斷的插入序列IS903，緊鄰IS903的下游的是一段20 bp反向重復序列(IRR2)，較之插入序列I

8、SEcp1的右側反向重復序列(IRR1)，(IRR2)與插入序列ISEcp1的左側反向重復序列(IRL)匹配的更好。我們還發(fā)現(xiàn)兩個5bp的正向重復序列單元正好位于從IRL到IRR2的DNA片段的兩側翼，這兩個重復單元很可能是由轉座子的插入產(chǎn)生的目標重復序列，由ISEcp1，ctx-m-14，截斷IS903及IRR2構成的區(qū)域極可能是一個有活性的轉座子，該轉座子可以介導了耐藥基因ctx-m-14的水平基因轉移。 質粒pKF3-70

9、中還有鐵轉運系統(tǒng)，它包括3個OFF，這3個ORF組成一個可以共轉錄的操縱子，在ORF4上游50 bp、110 bp、94 bp的位置分別有鐵攝取調節(jié)子(fur)結合位點，一個啟動子的-35框“TTGACA”及一個啟動子的-10框“TGGCATTAT”，ORF4編碼一個預測的胞漿間鐵離子結合蛋白，ORF5編碼一個預測的透性蛋白，其功能是作為鐵離子通道，ORF6編碼預測的ATP酶，功能是作為整個鐵離子ABC轉運自的引擎。eitD(ORF7)

10、基因位于ORF6的下游，它編碼的預測蛋白功能是能根據(jù)離子功能調節(jié)一些小分子物質的轉運，因此ORF7進一步加強了質粒pKF3-70的鐵離子轉運功能；質粒pKF3-70還編碼polⅢ-ε同系物的基因，根據(jù)比較基因組學研究推測，它可能賦予宿主菌以對紫外線所致突變及自發(fā)突變抵抗能力。pKF3-70獲得這樣一個基因使得他獲得更強的環(huán)境適應性。 總而言之，肺炎克雷伯質粒pKF3-70，是一個R100質粒的衍生物，并是一個可轉移的多重耐藥質粒