Ⅱ型膠原水凝膠—細(xì)胞復(fù)合物(可注射型組織工程軟骨)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 成熟的關(guān)節(jié)軟骨無血液供應(yīng)、神經(jīng)支配及淋巴回流，故軟骨的自身修復(fù)能力非常有限。直徑超過3mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損將由纖維組織填充，而非透明軟骨組織，不具有天然透明軟骨的生物化學(xué)和生物力學(xué)特征，通常會在生理負(fù)荷下發(fā)生退變，進(jìn)而造成關(guān)節(jié)功能障礙甚至喪失，成為導(dǎo)致肢體殘廢和勞動(dòng)能力喪失的主要原因之一。關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床十分常見，據(jù)統(tǒng)計(jì)在美國每年有25萬-50萬的軟骨損傷病人需要治療，而現(xiàn)有技術(shù)存在明顯缺陷：關(guān)節(jié)清理術(shù)僅能暫時(shí)緩

2、解臨床癥狀，不能阻止病程發(fā)展；關(guān)節(jié)融合術(shù)、關(guān)節(jié)切除成形術(shù)會使關(guān)節(jié)功能嚴(yán)重喪失；目前較為盛行的人工關(guān)節(jié)置換術(shù)也只是一種替代性手術(shù)，存在遠(yuǎn)期骨溶解和假體松動(dòng)等問題，且費(fèi)用昂貴，難以普遍采用。
　　 1984年瑞典醫(yī)學(xué)家Peterson等首次報(bào)道自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)(ACT)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后16周檢測證實(shí)關(guān)節(jié)軟骨缺損被透明軟骨修復(fù)。1987年瑞典歌德堡醫(yī)療中心Brittberg等報(bào)道采用該技術(shù)成功治療人關(guān)節(jié)軟骨缺損，這為隨后深

3、入開展的軟骨組織工程創(chuàng)造了有利條件。研究者們始終在努力尋找理想的種子細(xì)胞：自體軟骨細(xì)胞采集時(shí)會對捐獻(xiàn)部位造成損傷，采集量有限，體外培養(yǎng)擴(kuò)增費(fèi)用昂貴，擴(kuò)增后的細(xì)胞極易喪失原有表型且需通過二次手術(shù)才能完成治療；異體軟骨細(xì)胞的供體量也非常有限，存在免疫排斥反應(yīng)和傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)；坯胎干細(xì)胞具有全能性和無限增殖的能力，但如何有效地誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化，避免致瘤性，如何應(yīng)對倫理學(xué)問題阻礙了其應(yīng)用；成體干細(xì)胞，特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有

4、多項(xiàng)分化潛能，來源相對充足，獲取方法簡便易行，有可能成為關(guān)節(jié)軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞來源。然而，迄今為止，我們?nèi)匀粺o法獲取純化的干細(xì)胞，也不能精確控制其分化方向。
　　 支架的選擇同樣也困擾著研究者。無論是天然材料、人工合成材料、復(fù)合材料還是基因活化材料均有其局限性。隨著研究的進(jìn)展，天然來源的水凝膠越來越受到關(guān)注。Silverman等將纖維蛋白凝膠復(fù)合豬軟骨細(xì)胞，注射到裸鼠皮下，通過組織學(xué)檢查及糖胺聚糖、DNA和Ⅱ型膠原含量分

5、析顯示，在6、12周形成的固體軟骨較僅注射軟骨細(xì)胞或纖維蛋白凝膠的對照組有顯著差異。Chung等研究表明HA水凝膠不僅可以維持體外或體內(nèi)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的活力及表型，而且可以誘導(dǎo)MSCs向成軟骨細(xì)胞分化。作為種子細(xì)胞的載體，水凝膠具有很多優(yōu)勢，如保持接種細(xì)胞的高度均勻性，類似活組織的水合微環(huán)境，在體內(nèi)易于成膠及塑形等；同時(shí)天然成分具有良好的生物相容性，材料表面的活性基團(tuán)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，在體內(nèi)易于降解且降解產(chǎn)物無毒性。體外實(shí)驗(yàn)已證

6、實(shí)，作為關(guān)節(jié)軟骨主要組成成分的Ⅱ型膠原可誘導(dǎo)牛MSCs成軟骨分化，并且較Ⅰ型膠原組表現(xiàn)出更好的細(xì)胞形態(tài)和成軟骨的基因表達(dá)。但Ⅱ型膠原水凝膠的制備目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有較大差異，尤其是大動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。
　　 我國在組織工程軟骨方面的研究取得過舉世矚目的成果，如1997年曹誼林等在裸鼠背上成功培養(yǎng)出具有人耳輪廓的組織工程軟骨，近年來的基礎(chǔ)研究也緊跟國際先進(jìn)水平，但在成果轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用方面與國外先進(jìn)水平還有較大

7、差距。從ACT到MACI，國外已有大量的軟骨損傷病人從中獲益，但國內(nèi)目前尚無自主研發(fā)的組織工程軟骨應(yīng)用于臨床治療，同時(shí)也缺乏相應(yīng)的行業(yè)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心從1997年開始對組織工程軟骨及相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)行研究與開發(fā)，提出了組織工程軟骨的仿生構(gòu)建理念，在BMSCs的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定，關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)的量化研究，骨軟骨連接界面等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。本研究旨在開發(fā)一種制備Ⅱ型膠原水凝膠的方法，在檢測其生物安全性的基礎(chǔ)上

8、，與種子細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建成為可注射型組織工程軟骨，用以修復(fù)大動(dòng)物(小型豬)關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，驗(yàn)證該策略的修復(fù)效果。
　　 本研究采用骨髓有核細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對比研究兩種細(xì)胞的再生修復(fù)效果，探討一種更為安全、經(jīng)濟(jì)、簡便并易于向臨床推廣的關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)方法。
　　 研究方法
　　 1.以新鮮豬關(guān)節(jié)軟骨為原料，通過凍干、粉碎、鹽酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析、超純水透析以及離

9、心濃縮等一系列步驟分離、提純Ⅱ型膠原蛋白，并制成溫敏性水凝膠。對提取的Ⅱ型膠原蛋白進(jìn)行氨基酸成分分析，對制備的水凝膠進(jìn)行大體、組織學(xué)觀察，并初步測試其膠凝化特性和生物相容性。
　　 2.以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離、培養(yǎng)BMSCs與Ⅱ型膠原水凝膠支架復(fù)合，裝載于由半透膜制成的擴(kuò)散盒中，無菌手術(shù)下放置于兔膝關(guān)節(jié)腔中，初步觀察Ⅱ型膠原水凝膠-兔BMSCs復(fù)合物(可注射型組織工程軟骨)的體內(nèi)成軟骨情況。
　　 3.以貴州小香

10、豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，無菌手術(shù)下于膝關(guān)節(jié)股骨滑車關(guān)節(jié)面造成直徑6mm的全層軟骨缺損。20頭12月齡貴州小香豬，隨機(jī)分為4組，每組10膝，A組為空白對照組，B組為單純Ⅱ型膠原水凝膠組，C組為Ⅱ型膠原水凝膠復(fù)合BMSCs組，D組為Ⅱ型膠原水凝膠復(fù)合BNCs組；術(shù)后4周、8周取材，分別進(jìn)行MRI、大體、體式顯微鏡、組織學(xué)觀察及O'Driscoll組織學(xué)評分對各分組修復(fù)效果進(jìn)行評價(jià)。
　　 研究結(jié)果
　　 1.建立了以豬關(guān)節(jié)軟骨為原料的

11、Ⅱ型膠原水凝膠提取、制備技術(shù)。制備的水凝膠支架具有良好的生物相容性和溫敏性膠凝化特性--在37℃條件下5-10min轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀。
　　 2.自制擴(kuò)散盒包裹可注射型組織工程軟骨，無菌手術(shù)下置入兔膝關(guān)節(jié)腔中。術(shù)后4周MRI示兔關(guān)節(jié)腔無明顯積液，擴(kuò)散盒完整無破損；術(shù)后8周取材觀察，傷口愈合良好、無畸形，關(guān)節(jié)腔少量清亮積液、滑膜無明顯充血和增生，擴(kuò)散盒中的組織工程軟骨可見明顯的成軟骨反應(yīng)，顏色灰白呈半透明狀；組織學(xué)觀察有大量GAGs表

12、達(dá)，細(xì)胞形態(tài)類似軟骨細(xì)胞并形成多量軟骨陷窩。
　　 3.成功建立貴州小香豬膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型和可注射型組織工程軟骨植入技術(shù)。術(shù)后8周大體觀察實(shí)驗(yàn)組缺損處為軟骨樣組織所修復(fù)，空白對照組和單純膠原組修復(fù)不完全；體式顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織表面平整，骨軟骨連接界面及修復(fù)組織和鄰近軟骨界面整合滿意；組織學(xué)證實(shí)修復(fù)組織為透明軟骨樣組織；O'Driscoll組織學(xué)評分實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于空白對照組和單純膠原組，BMSCs組和BNCs組之間無明

13、顯差異。
　　 研究結(jié)論
　　 1.建立了Ⅱ型膠原水凝膠提取、制備技術(shù)，制備的水凝膠具有良好的生物相容性和溫敏性膠凝化特性。
　　 2.建立了種子細(xì)胞(BMSCs和BNCs)分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)，并與Ⅱ型膠原水凝膠復(fù)合構(gòu)建可注射型組織工程軟骨，其細(xì)胞密度為105-6/ml。
　　 3.自制擴(kuò)散盒包裹可注射型組織工程軟骨，兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)8周，初步證實(shí)該組織工程軟骨具有良好的成軟骨能力，為下一步大動(dòng)物在體修復(fù)

14、實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。
　　 4.建立小型豬麻醉、手術(shù)和復(fù)蘇技術(shù)，成功構(gòu)建了豬膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型，為組織工程軟骨動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的評價(jià)載體。
　　 5.Ⅱ型膠原水凝膠復(fù)合BMSCs或BNCs構(gòu)建的可注射型組織工程軟骨植入體內(nèi)可修復(fù)直徑為6mm的貴州小香豬膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，修復(fù)組織為透明軟骨樣組織，并與周圍界面整合良好。術(shù)后8周兩組修復(fù)效果無明顯差異(O'Driscoll評分值分別為18±0.70711和17.8±0