Pcd86-rae-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠的深入鑒定及細(xì)胞免疫功能分析.pdf

1、機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫緊密聯(lián)系，NK細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞(DC)之間的對(duì)話(crosstalk)不僅影響天然免疫功能，對(duì)獲得性免疫的形成、發(fā)展及結(jié)果有深遠(yuǎn)的影響。DC通過(guò)直接接觸NK細(xì)胞及分泌細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞，并通過(guò)上調(diào)NK細(xì)胞的活性而增強(qiáng)其抗腫瘤作用。同時(shí)活化的NK細(xì)胞可以激活DC，進(jìn)一步影響T細(xì)胞的活化及是否向Th1方向發(fā)展，從而最終影響機(jī)體的免疫防御和免疫監(jiān)視功能。
　　 在DC與NK細(xì)胞之間的相互作用中，DC表面MI

2、CA分子(或其他NKG2D配體)與NK細(xì)胞表面NKG2D受體之間的相互作用，不僅直接介導(dǎo)兩者之間的對(duì)話，并在MICA陽(yáng)性腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮著激活NK細(xì)胞，誘導(dǎo)DC吞噬凋亡腫瘤碎片并交叉遞呈抗原、啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答的作用。但若DC表面持續(xù)高表達(dá)NKG2D配體，對(duì)NK細(xì)胞具有怎樣的影響，目前尚不清楚。
　　 為此，我們制備了DC細(xì)胞持續(xù)表達(dá)MICA(小鼠為RAE-1ε)分子的pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠，并完成基因整合的初步篩選

3、。本研究主要對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行RAE-1ε蛋白表達(dá)和組織分布的鑒定，以及相關(guān)細(xì)胞免疫功能分析。研究?jī)?nèi)容主要分為以下兩個(gè)部分：
　　 第一部分：pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白表達(dá)鑒定
　　 目的：進(jìn)一步明確10只PCR鑒定陽(yáng)性小鼠體內(nèi)RAE-1ε蛋白的表達(dá)情況。
　　 方法：猝死小鼠，收取小鼠肺臟、肝臟、胸腺、腸等組織，通過(guò)Western Blot鑒定小鼠肝臟組織是否表達(dá)RAE-1ε，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各

4、組織內(nèi)RAE-1ε的表達(dá)情況，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步鑒定脾臟單細(xì)胞懸液內(nèi)DC、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況。并在此基礎(chǔ)上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行常規(guī)的交配傳代及常規(guī)PCR鑒定。
　　 結(jié)果：1)在10只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠中，得到抗原遞呈細(xì)胞表面持續(xù)表達(dá)RAE-1ε蛋白的3只小鼠；2)3只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠傳代到F4代，后代總的陽(yáng)性率為51.69％以上，有望得到pCD86-RAE-1ε純合子轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 結(jié)論：通過(guò)基因整合和蛋

5、白表達(dá)水平的篩選，獲得3只親代小鼠，其交配的子代小鼠可于后續(xù)的相關(guān)研究。
　　 第二部分：pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞免疫功能分析
　　 目的：觀察抗原遞呈細(xì)胞持續(xù)表達(dá)RAE-1ε對(duì)相關(guān)細(xì)胞免疫功能的影響。
　　 方法：首先觀察陽(yáng)性小鼠的生命體征，并取轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟、淋巴結(jié)制備成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞數(shù)目占總淋巴細(xì)胞的比例，表面受體NKG2D的表達(dá)，殺傷靶細(xì)胞活性，分泌IF

6、N-γ的能力。同時(shí)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的比例及表面NKG2D的表達(dá)情況。其次，取轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟來(lái)源的抗原遞呈細(xì)胞(高表達(dá)RAE-1ε)，刺激野生型小鼠NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面NKG2D受體表達(dá)、細(xì)胞毒活性及分泌IFN-γ的能力。最后，通過(guò)ELISA法比較轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠血清內(nèi)sRAE-1ε和RAE-1ε抗體含量的差異。
　　 結(jié)果：除部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)脫毛癥狀外，未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)的異常生命體征。NK細(xì)胞

7、和CTL細(xì)胞頻率均未見(jiàn)明顯變化，且其細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞的殺傷活性及分泌IFN-γ的能力均發(fā)生顯著性升高；CD4+T細(xì)胞頻率未發(fā)生改變，但表面NKG2D的表達(dá)明顯上調(diào)。利用高表達(dá)RAE-1ε的抗原遞呈細(xì)胞刺激野生型小鼠淋巴細(xì)胞，其CTL細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)、細(xì)胞毒活性及分泌IFN-γ的能力均未發(fā)生明顯改變；而NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力雖然未發(fā)生改變，但其NKG2D表達(dá)和細(xì)胞毒活性均明顯上調(diào)。這提示高表達(dá)RAE-1ε