供體脾淋巴細(xì)胞輸注及FK506對(duì)同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、【背景】
　　器官移植是很多臟器疾病終末期的唯一有效方法，但是移植排斥反應(yīng)是移植后影響臟器功能正常發(fā)揮和受者長(zhǎng)期存活的關(guān)鍵因素之一?；瘜W(xué)免疫抑制劑如環(huán)孢素A(cyclosporine,CsA)和普樂(lè)可復(fù)(Prograf，Tacrolimus，F(xiàn)K506)等先后應(yīng)用，器官移植得到巨大發(fā)展。然而，現(xiàn)有的免疫抑制劑抑制排斥反應(yīng)的劑量，在一定程度上，也限制了機(jī)體對(duì)感染和腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，抑制劑的自身毒副作用影響了其自身的長(zhǎng)期使用。組合

2、使用免疫抑制方法已被用來(lái)減輕藥物的毒副作用。在心臟移植術(shù)前給予供體特異輸注(donor-specific transfusion，DST)預(yù)先處理，可減少免疫抑制劑的劑量，又能延長(zhǎng)移植物的生存。
　　FK506(tacrolimus)是1984年日本藤澤制藥公司的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)力選擇性大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)K506抗移植排斥反應(yīng)作用是環(huán)孢素A的10～100倍，可減少器官移植接受者的激素用量。1993年以來(lái)，

3、國(guó)際上已有70余個(gè)國(guó)家將FK506臨床用于肝、腎、心臟等器官移植后的抗排斥反應(yīng)治療。1989年美國(guó)肝臟移植專家Starzl首次將FK506用于肝臟移植，1994年美國(guó)國(guó)家醫(yī)藥食品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于肝臟移植，1997年批準(zhǔn)用于腎移植。2006年3月30日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)FK506用于心臟移植。普樂(lè)可復(fù)的毒副作用主要有震顫、頭痛、睡眠障礙、高血壓、腎功減退和糖耐量降低。
　　

4、【目的】
　　研究在術(shù)前一天進(jìn)行供體特異輸注(donor-specific transfusion,DST)及不同劑量FK506對(duì)同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)的影響。初步探討尋找合適的免疫抑制劑劑量，為臨床應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】
　　1、脾淋巴懸液的制備：以BALB/C小鼠取脾后，在無(wú)菌皿內(nèi)加5mlEZ-Sep TM Mouse 1X淋巴細(xì)胞分離液(使用前搖勻)，在200目一次性尼龍網(wǎng)上用針芯

5、研磨成均勻胞漿。后取約1×107個(gè)細(xì)胞，加入1mlPBS液待用。
　　2、供體特異輸注：各組C57BL/6受體于術(shù)前1天供體特異輸注(DST)1次，輸注劑量為0.5ml(5×106個(gè))脾細(xì)胞，尾靜脈注射入靜脈系統(tǒng)。
　　3、模型建立：按Chen方法進(jìn)行，就是在戊巴比妥鈉40-50mg/kg腹腔麻醉的條件下將供體BALB/C小鼠心臟的無(wú)名動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別與受體C57BL/6的頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外靜脈進(jìn)行端端吻合，植入頸部皮下。

6、>　　4、DST及FK506對(duì)同種異體小鼠心臟移植的影響：將受體C57BL/6小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：
　?、?、第1組：即對(duì)照組，對(duì)受體無(wú)任何處理，即直接心臟移植；
　?、?、第2組：DST組，術(shù)前1d單純給予受體DST；
　　③、第3組：DST+FK506(2mg/kg/d)組，術(shù)前1d給予受體DST，加較大劑量FK506(2mg/kg/d)；
　?、?、第4組：DST+FK506(0.3mg/kg/

7、d)組，術(shù)前1d給予受體DST，加較小劑量FK506(0.3mg/kg/d)。第3組和第4組均從手術(shù)當(dāng)天開始給予FK506，每日一次，腹腔注射，到供心停跳或者移植后40天停止。
　　5、術(shù)后處理與觀察：術(shù)后小鼠盡快復(fù)溫，獨(dú)籠飼養(yǎng)。
　?、?、每天通過(guò)視診和觸診檢測(cè)移植心情況，早期(72h)出現(xiàn)心跳緩慢無(wú)力或心跳停止，視為手術(shù)失敗；受體與移植心存活超過(guò)72h，認(rèn)為手術(shù)成功。移植心跳動(dòng)停止視為排斥終點(diǎn)。
　?、?、各組分別于移

8、植后7天取移植心臟作常規(guī)病理學(xué)處理，HE染色光鏡下檢查，對(duì)急性排斥反應(yīng)強(qiáng)度的分級(jí)參照Stanford標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。
　　③、移植后7天檢測(cè)血清白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)及干擾素-γ(IFN-γ)水平的變化，按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
　?、?、在心臟移植后15d，取DST+FK506(2mg/kg/d)組、DST+FK506(0.3mg/kg/d)組受體的脾細(xì)胞做MLR，以正

9、常C57BL/6小鼠脾細(xì)胞為對(duì)照，分別測(cè)定對(duì)供體BALB/C小鼠及第三方C3H小鼠脾細(xì)胞的單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte reaction,MLR)。
　　【結(jié)果】
　　1、移植心存活時(shí)間：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件。生存數(shù)據(jù)分析用Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank檢驗(yàn)。Log-Rank檢驗(yàn)比較結(jié)果顯示，DST+FK506(2mg/kg/d)組及DST+FK506(0.3mg/kg/d

10、)組其生存時(shí)間比DST組及對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析以DST+FK506(0.3mg/kg/d)組顯著延長(zhǎng)移植物的生存，可見DST加較小劑量FK506延長(zhǎng)移植物生存效果最好。
　　2、病理學(xué)觀查：移植術(shù)后第7天，第1組（對(duì)照組）有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，大片心肌變性、壞死，心肌血管充血，血管內(nèi)膜增厚，屬于急性排斥分級(jí)第4級(jí)；第2組（DST組）有較多淋巴細(xì)胞，小片心肌變性、

11、壞死，屬于急性排斥分級(jí)第3級(jí)；第3組（DST+FK506(2mg/kg/d)組）有中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，單灶狀心肌變性、壞死，心肌水腫較輕，屬于分級(jí)第2級(jí)；第4組（DST+FK506(0.3mg/kg/d)組）有中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌壞死數(shù)目較少，屬于分級(jí)第2級(jí)。
　　3、細(xì)胞因子檢測(cè)：術(shù)后第7天，血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，第3組和第4組IL-2和IFN-γ水平均低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

12、.01)。血清第3組和第4組IL-4和IL-10高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且第3組高于第4組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：在心臟移植后15d，DST+FK506(2mg/kg/d)組和DST+FK506(0.3mg/kg/d)組C57BL/6小鼠脾細(xì)胞針對(duì)供體BALB/C小鼠抗原均表現(xiàn)出顯著低反應(yīng)性(與MLR正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為P<0.01)，同時(shí)對(duì)第三方C

13、3H小鼠脾細(xì)胞也表現(xiàn)出低反應(yīng)性(與MLR正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為P<0.01)。
　　【結(jié)論】
　　1.成功的建立了小鼠頸部異位心臟急性排斥反應(yīng)的模型，術(shù)后移植心臟復(fù)跳較快，手術(shù)成功率較高。
　　2.脾淋巴懸液的制備對(duì)DST干預(yù)有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)的研磨脾臟方法獲得足夠的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行DST預(yù)處理，減少非淋巴細(xì)胞雜質(zhì)。
　　3.FK506和DST的聯(lián)合使用，對(duì)小鼠異位心臟移植的急性排斥反應(yīng)有明顯的抑制，顯