2型糖尿病大鼠血清AGEs及其與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)分析.pdf

1、目的：晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationend-products，AGEs)可引起體內(nèi)組織一系列病理生理改變，是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的重要致病因素。此外，在健康人群中AGEs也隨年齡增加在組織中持續(xù)積累，并參與衰老過程。AGEs通過與其受體或AGEs結(jié)合蛋白相互作用，干擾骨重建過程，導(dǎo)致糖尿病骨代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。但AGEs在糖尿病血清或骨組織內(nèi)的表達(dá)水平如何，及其與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性，目前有關(guān)的研究甚少。本研究主要

2、目的是利用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，結(jié)合離體骨密度(BMD)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和生物力學(xué)試驗(yàn)等指標(biāo)，并測(cè)定骨轉(zhuǎn)換血清生化指標(biāo)和炎性因子，觀察大鼠血清AGEs含量及其與上述指標(biāo)的相關(guān)性。 方法：3月齡健康雄性Wistar大鼠30只，實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體重編號(hào)，隨機(jī)取出6只作正常對(duì)照組，喂以普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周(不限每日熱量)，禁食12h后一次性左下腹腔

3、注射STZ(30mg/kg)，正常對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。每周固定時(shí)間大鼠尾靜脈采血測(cè)血糖，做腹腔內(nèi)葡萄糖耐量(Intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)。對(duì)于血糖值≥30mmol/L者，皮下注射小劑量長效胰島素(0.4U/100g體重)作為基礎(chǔ)胰島素量以維持生命，但不明顯影響血糖水平。成模20周后對(duì)大鼠體重(BW)、空腹血糖(FBG)、胰島素水平(INS)進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(

4、HOMA-IR)、胰島素敏感性指數(shù)(IAI)。頸動(dòng)脈取血處死所有大鼠，測(cè)定血清Ca、P、TG、TC、骨鈣素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)水平以及抗凝血糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)水平。留取腰椎、股骨、脛骨等骨標(biāo)本，用DEXA法測(cè)定腰椎(L1-L6)及股骨BMD，用萬能材料分析儀行腰椎(L5)壓縮試驗(yàn)及股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，取右側(cè)脛骨上端制備不脫鈣骨切片做骨組織形

5、態(tài)計(jì)量學(xué)分析。同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定大鼠血清AGEs含量，以此血清AGEs含量間接反映骨組織AGEs含量。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量樣本均數(shù)組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。并分別對(duì)2型糖尿病大鼠血清AGEs與BMD、骨生物力學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)及TRAP、HbA1c、IL-6、IGF-1、BGP等血清生化標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1

6、、體重與血糖的變化：與普通飼料喂養(yǎng)的正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病組大鼠高脂飲食8周后體重為445.45±15.45g、394.10±13.15g，明顯增加(P＜0.01)，注射STZ后體重漸下降，最終在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定448.37±56.02g、637.85±45.63g，有顯著差異(P＜0.01)；單純高脂飲食兩組大鼠血糖沒有顯著性差異，注射STZ后糖尿病組大鼠血糖為9.47±0.68mmol/L、5.92±0.31mmol/L，明顯升高

7、(P＜0.01)。 2、血清AGEs含量、胰島素與胰島素抵抗：糖尿病組大鼠血清AGEs為5.80±1.13U/ml、1.29±0.38U/ml，F(xiàn)PG為9.47±0.68mmol/L、5.92±0.31mmol/L，F(xiàn)INS為17.45±3.14μIU/ml、12.27±2.70μIU/ml，HOMA-IR為3.67±1.09、1.38±0.14，均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。 3、BMD與骨生物力學(xué)特性：糖尿病

8、組骨灰干重比為0.469±0.011、0.511±0.026，腰椎L1BMD為0.147±0.012g/cm2、0.181±0.014g/cm2，L2BMD為0.142±0.011g/cm2、0.172±0.014g/cm2，L3BMD為0.134±0.013g/cm2、0.163±0.013g/cm2，L4BMD為0.132±0.014g/cm2、0.154±0.012g/cm2，L5BMD為0.118±0.012g/cm2、0.15

9、7±0.014g/cm2，LGBMD為0.106±0.014g/cm2、0.136±0.013g/cm2，股骨BMD0.186±0.025g/cm2、0.213±0.013g/cm2，腰椎最大載荷157.61±35.32N、234.73±18.36N，彈性模量58.64±10.86Mpa、79.15±7.82Mpa，股骨最大載荷137.13±11.70N、206.78±33.42N，彈性模量6.52±1.48Gpa、9.56±2.34G

10、pa，最大彎曲應(yīng)力157.15±27.76Mpa、207.34±34.17Mpa，均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，證明2型糖尿病大鼠存在骨質(zhì)疏松。 4、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)：糖尿病組骨小梁相對(duì)體積22.09±0.64％、30.72±3.26％，骨小梁厚度68.07±5.27um、79.13±5.47um，骨小梁數(shù)量0.258±0.056個(gè)/mm、0.316±0.043個(gè)/mm，骨礦化沉積率0.64±0.11um/d、0.9

11、2±0.21um/d，骨形成率0.014±0.001％/year、0.073±0.003％/year，均顯著降低(P＜0.01)，而骨小梁分離度208.13±20.43um、155.69±7.83um，單位骨小梁面積上破骨細(xì)胞數(shù)125.86±3.42n/mm、73.47±0.43n/mm，均顯著升高(P＜0.01)。 5、血清生化指標(biāo)：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組血清鈣2.37±0.11mmol/L、2.45±0.13mmol/L

12、，磷2.24±0.51mmol/L、2.50±0.73mmol/L，水平均降低，但無明顯差異；血清TRAP為16.76±3.54g、8.74±3.64g，TG為1.58±0.36mmol/L、0.78±0.24mmol/L，TC為1.69±0.13mmol/L、1.48±0.11mmol/L，HbAlc為86.29+12.38每10gGHB吸光度、45.53+10.93每10gGHB吸光度，尿羥脯氨酸/肌酐為0.0176±0.0076、

13、0.0063±0.0024，均升高，血清BGP為5.49±1.39μg/L、6.94±0.59μg/L，降低，差異均有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。 6、血循環(huán)中細(xì)胞因子的水平：IL-6為182.35±19.63pg/ml、122.62±10.13pg/ml，水平較正常組明顯升高，IGF-I334.64±26.73ng/ml、443.54±27.34ng/ml，水平較正常組明顯降低，均有顯著性差異(P＜0.01)。

14、 7、相關(guān)分析：血清AGEs與體重、灰干重比、股骨BMD、股骨最大彎曲應(yīng)力、股骨彈性模量、腰椎BMD、腰椎最大載荷、骨小梁相對(duì)體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨礦化沉積率、骨形成率、BGP、IGF-I成顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.712，P＜0.01；r=-0.618，P＜0.05；r=-0.618，P＜0.05；r=-0.710，P＜0.01；r=-0.699，P＜0.01；r=-0.693，P＜0.01；r=-0.847，P＜0.01；r=

15、-0.631，P＜0.05；r=-0.713，P＜0.01；r=-0.674，P＜0.01；r=-0.687，P＜0.01；r=-0.703，P＜0.01；r=-0.604，P＜0.05；r=-0.542，P＜0.05)，而AGEs與FPG、HbA1c、IL-6、骨小梁分離度、單位骨小梁面積上破骨細(xì)胞數(shù)成顯著正相關(guān)(r=0.895，P＜0.01;r=0.964，P＜0.01；r=0.534，P＜0.05；r=0.763，P＜0.01；r

16、=0.836，P＜0.01)。 結(jié)論： 1、高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量STZ注射，成功建立了2型糖尿病大鼠模型，與人類2型糖尿病代謝特征相似，是研究人類2型糖尿病較理想的動(dòng)物模型。該模型大鼠具有高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗特點(diǎn)。 2、糖尿病大鼠BMD、生物力學(xué)指標(biāo)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)反映成骨活性的參數(shù)均降低，表明糖尿病模型存在骨質(zhì)疏松現(xiàn)象。 3、糖尿病大鼠血清AGEs含量顯著增高，并且AGEs與BMD、力學(xué)指

17、標(biāo)、形態(tài)計(jì)量學(xué)反映成骨活性的參數(shù)有顯著負(fù)相關(guān)，說明AGEs參與糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。其潛在機(jī)制可能是AGEs與其受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生成大量氧自由基，從而激活對(duì)氧自由基敏感的轉(zhuǎn)錄因子核因子(NF)-KB，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子IGF-1、IL-6、FNF-α和黏附分子的產(chǎn)生，導(dǎo)致成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化、生成和作用受損，從而干擾骨重建，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，有效的血糖控制，減少AGEs生成，可以延緩糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)