禽坦布蘇病毒的分離鑒定與檢測技術(shù)研究.pdf

1、禽坦布蘇病毒(Tenbusu，TMUV)是禽坦布蘇病毒病的主要病原。該病2010年4月首先在我國東南沿海養(yǎng)鴨場爆發(fā)，受感染后病鴨產(chǎn)蛋量驟降、采食量下降，剖檢病鴨可見病鴨卵巢出血、炎癥、萎縮。隨后研究中亦在鵝、雞和麻雀中分離到該病毒。坦布蘇病毒病的流行給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失。
　　本文根據(jù)從30份臨床病料中分離鑒定了7株坦布蘇病毒，并分別命名為NJ110417、NJ120807、NJ120812、NJ1208、YY2、JSg（鵝源

2、）、WZ1302。分離的病毒不能凝集雞、鼠、人等紅細(xì)胞。將分離到的病毒接種SPF雞胚后，雞胚出現(xiàn)死亡，死亡雞胚胚體通紅出血，雞胚尿囊液渾濁，有尿酸鹽沉淀。分離病毒接種雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為圓縮脫落。根據(jù)已登錄報(bào)道的坦布蘇病毒序列，針對其保守NS5序列，設(shè)計(jì)了一對引物，建立了RT-PCR方法，該方法特異、敏感，而且能從臨床病料中直接檢測到坦布蘇病毒的核酸。
　　根據(jù)已發(fā)布的坦布蘇病毒的全基因組序列，設(shè)

3、計(jì)引物，擴(kuò)增坦布蘇病毒核酸的各個(gè)區(qū)域，PCR產(chǎn)物測序、拼接最終獲得了YY1、JSg和YY2三株坦布蘇病毒分離株的全基因組序列。序列分析結(jié)果顯示三株坦布蘇病毒分離株同源性較高，2010年分離株YY1和2012年分離株YY2全基因組水平同源性為99.5％，與JSg同源性為99.7％; YY1與其他黃病毒毒株的比較中，與MM-175和Sitiawan同源性分別為96.5％和97％，與Bagaza和Nataya毒株的同源性分別為79.9％和79

4、.7％，表明該三株毒株與黃病毒科病毒有較高的同源性。而且在鴨和鵝分離株間，以及不同發(fā)病高峰期分離株之間具有高度的同源性。
　　最后本研究對坦布蘇病毒抗體檢測方法進(jìn)行了研究，即建立了基于全病毒包被的ELISA檢測方法。全病毒包被ELISA條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的ELISA檢測程序?yàn)門ris-HCl緩沖液稀釋抗原至6μg/mL，4℃過夜包被抗原，2％脫脂奶封閉，1∶200稀釋待檢測血清，37℃孵育1h，1∶1000稀釋HRP羊抗鴨，3