辣椒素抑制缺氧-復(fù)氧導(dǎo)致的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)研究辣椒素對離體缺氧/復(fù)氧大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞(ATⅡ)凋亡的影響,以探討細(xì)胞凋亡的可能通路。
　　方法:細(xì)胞懸液以0.7~0.8×10^5個(gè)/ml密度接種于6孔板內(nèi),用含有10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基(DMEM)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ATⅡ,透射電子顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)(SABC-DAB)的方法進(jìn)行鑒定;將上述培養(yǎng)并鑒定成功的細(xì)胞株分為六組:正常對照組(C組)、單純?nèi)毖?復(fù)氧組(HR組)、缺氧前1h加辣椒素

2、組(CapB組)、缺氧開始時(shí)加辣椒素組(CapH組)、復(fù)氧開始時(shí)加辣椒素組(CapR組)、辣椒平組(CapZ組),除CapZ組n=3外,其余各組n=10。C組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞,未經(jīng)任何處理;HR組在37℃1%O294%N25%CO2缺氧環(huán)境中用無糖Hank’ s緩沖液缺氧24h,不含F(xiàn)BS的DMEM于37℃5%CO2正常條件下復(fù)氧24h;CapB組為在缺氧前1h加入50uM辣椒素,待作用1h后換成缺氧用無糖Hank’ s緩沖液培養(yǎng),余處

3、理同HR組;CapH組為在缺氧開始時(shí)加入50uM辣椒素,使其在缺氧過程中起作用,余處理同HR組;CapR組為缺氧24h換液后,在復(fù)氧開始時(shí)加入50uM辣椒素,并繼續(xù)在復(fù)氧條件下培養(yǎng)24h;CapZ組為缺氧前1.5h加入10uM辣椒平預(yù)處理,余處理同CapH組。各組均在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)24h后用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。采用熒光定量 PCR(Q-PCR)檢測 C組細(xì)胞生長達(dá)培養(yǎng)瓶70%-80%, HR組、Ca

4、pH組缺氧24h復(fù)氧24h后caspase-9的基因表達(dá)(n=6),探討ATⅡ凋亡的可能通路。
　　結(jié)果:(1)ATⅡ胞漿內(nèi)含有特征性的板層小體,能特異性地表達(dá)SP-A、SP-C;
　　(2)①缺氧/復(fù)氧可引起ATⅡ細(xì)胞凋亡,并且發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。倒置顯微鏡下見C組細(xì)胞貼壁連接成片,細(xì)胞膜、細(xì)胞核完整,上清液干凈;HR組、CapB組、CapH組、CapR組、CapZ組經(jīng)過缺氧24h復(fù)氧24h后,貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞變圓或

5、長出分支,有些細(xì)胞呈顆粒狀,細(xì)胞膜完整、但胞核脆裂,上清液中見呈白色顆粒狀脫落的細(xì)胞;②與HR組比較,CapH組貼壁細(xì)胞相對較多,脫落的細(xì)胞減少;而CapB組、CapR組、CapZ組與HR組比較,無明顯變化;③經(jīng)過辣椒平處理后,CapZ組脫落的細(xì)胞較CapH組增多,貼壁細(xì)胞減少。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示:①與C組比較,HR組、CapB組、CapH組、CapR組、CapZ組細(xì)胞凋亡率明顯升高(p<0.05);②與HR組比較,

6、CapH組細(xì)胞凋亡率明顯降低(p<0.05);CapB組、CapR組、CapZ組ATⅡ細(xì)胞凋亡率無明顯變化(p>0.05);③與CapB組、CapR組比較,CapH組細(xì)胞凋亡率明顯減少(p<0.05);④與CapH組比較,CapZ組ATⅡ凋亡百分率明顯上升(p<0.05)。
　　(4)與C組比較,HR組caspase-9 mRNA含量約增高3倍,在CapH組稍增加;與HR組比較,CapH組caspase-9 mRNA含量約降低2倍