辛伐他汀對雷帕霉素作用下的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響.pdf

1、實驗背景和目的：冠心病(CHD)是心血管疾病中最常見、最重要的一種。它作為危害人類健康的“第一殺手”,已波及全球,成為許多發(fā)達國家的主要災難。冠心病發(fā)病實質(zhì)是心肌缺血,即冠狀動脈管腔不同程度的狹窄或阻塞而造成心肌缺血、缺氧,從而發(fā)生一系列的臨床癥狀(如胸悶、心絞痛),甚至發(fā)生心肌梗死危機生命。因此,保持血管通暢,保證心肌血供是治療關鍵。現(xiàn)今冠心病的治療可分為藥物治療、內(nèi)科介入治療和外科搭橋治療三種,其中介入和藥物聯(lián)合治療是主要的治療手段

2、。介入治療開始應用至今已經(jīng)有超過30年的歷史,技術已較成熟并成為冠心病治療的主要手段。目前,藥物涂層支架(DES)已代替最初的金屬裸支架(BMS)占據(jù)著介入治療主要市場。以雷帕霉素(RAPA)涂層支架為例,其植入后通過特別控制支架聚合涂層,在血管內(nèi)釋放雷帕霉素這種抗腫瘤藥物,抑制血管內(nèi)皮及平滑肌細胞增殖遷移,從而達到降低再狹窄率的目的。除此以外,長期的藥物治療是冠心病患者治療的基礎。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶

3、抑制劑,是治療冠心病的常規(guī)用藥。同時,他汀是一類多效型的藥物,除了降低血脂作用外,還能促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移,誘導一氧化氮(NO)的合成和釋放,抑制細胞凋亡和抗炎等作用。本實驗以辛伐他汀(SIM)為例,以對心臟物質(zhì)交換有著重要地位的心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)為研究對象,觀察藥物支架植入后,辛伐他汀與雷帕霉素共同作用下的心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響。
　　實驗方法：第一部分:RAPA對CMECs的影響1.酶消化法體外培養(yǎng)大鼠C

4、MECs,取第2-3代細胞進行下一步實驗。2.CMECs完全隨機分為5組并加入不同濃度的RAPA,分別為對照組、0.01μg/L組、0.1μg/L組、1μg/L組及10μg/L組。干擾時間為24h。3.用MTT法檢測CMECs的增殖情況,用transwell法檢測CMECs的遷移能力。4.選擇合適的RAPA干擾濃度(抑制增殖與遷移能力居中)。
　　第二部分:SIM對RAPA作用下CMECs的影響1.CMECs隨機分為4個大組,分別

5、為對照組,SIM組,RAPA組和SIM+RAPA組。其中SIM+RAPA組又分為RAPA(1μg/L)+SIM(0.01μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(0.1μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(1μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(10μmol/L)組。干擾時間為24小時。2.分別用MTT和transwell法檢測各組增殖和遷移能力;用Hoechs(t33258)染色檢測細胞凋亡情況;用NO

6、分泌活性的Griess反應試劑盒檢測NO的合成和分泌。
　　實驗結(jié)果：1.體外成功培養(yǎng)有內(nèi)皮細胞特征的CMECs。2.RAPA能顯著抑制CMECs的增殖與遷移能力,并呈濃度依賴性,即濃度越高,其抑制能力越強。本實驗選取1μg/L作為基礎濃度,進行下一步實驗。3.單獨的SIM組(1μmol/L)能促進CMECs的增殖和遷移能力,抑制細胞凋亡,促進NO的合成和分泌。4.將不同濃度的SIM加入RAPA(1μg/L)后,能改善RAPA對細

7、胞增殖和遷移的抑制作用,對增殖和遷移的抑制改善最明顯濃度分別出現(xiàn)在1μmol/L和0.1μmol/L。然而,改善最明顯濃度均不出現(xiàn)在10μmol/L,SIM在1μg/L及以下的濃度,對RAPA抑制的改善作用呈濃度依賴性,即濃度越高,改善作用越明顯;在1μg/L以上的濃度改善作用不顯著。5.單獨的RAPA使CMECs的凋亡率升高,加入SIM后能抑制其誘導凋亡的作用,抑制最明顯的濃度出現(xiàn)在1μg/L。6.RAPA能抑制CMECs的NO合成與

8、分泌,SIM能改善其抑制作用。
　　結(jié)論：RAPA為一種抗腫瘤藥物,能夠顯著抑制CMECs的增殖和遷移,并呈濃度依賴性。除此以外,它還能誘導CMECs的凋亡,抑制CMECs的NO合成和分泌,對CMECs有一定的損傷作用。SIM(1μmol/L)能促進CMECs的增殖和遷移,抑制凋亡,促進NO的合成和分泌。在RAPA干擾的CMECs中加入不同濃度的SIM共孵育24h,可以改善RAPA的抑制作用,降低凋亡率,從而抑制其對CMECs的損