冠心病患者血清胰島素水平與循環(huán)EPCs及冠脈病變的相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的: 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EndothelialProgenitorCell，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，表達(dá)干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)抗原。在血管損傷時(shí)，EPCs從骨髓動(dòng)員到外周血，遷移、黏附到損傷區(qū)域，增殖、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化，維持內(nèi)皮細(xì)胞單層完整性，從而起到修復(fù)損傷血管，預(yù)防冠心病發(fā)生的作用。但EPCs不是自我更新的干細(xì)胞，它是一種定向分化，具有復(fù)制衰老特性的祖細(xì)胞，許多冠心病危險(xiǎn)因素，如老齡、吸

2、煙、高脂血癥、糖尿病均可降低EPCs數(shù)量，損傷EPCs生物學(xué)功能。胰島素抵抗(insulinresistance，IR)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，被認(rèn)為是冠心病、糖尿病和代謝綜合征發(fā)病的“共同土壤”。既往研究認(rèn)為IR致冠心病的機(jī)制主要包括：內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂、平滑肌細(xì)胞增生、脂質(zhì)代謝紊亂、誘導(dǎo)血栓形成。新近有報(bào)道稱在以IR為中心的代謝綜合癥患者中，外周血循環(huán)EPCs數(shù)量明顯減少，但是否血清胰島素與外周血循環(huán)EPCs數(shù)量及功能有直接

3、相關(guān)性目前未見報(bào)道。 因此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討胰島素是否對(duì)外周血循環(huán)EPCs產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展，期望為研究冠心病發(fā)病機(jī)制提供新的思路，進(jìn)一步為冠心病的防治尋找新的靶點(diǎn)。 方法: 1.循環(huán)：EPCs培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 密度梯度離心法獲取人外周血單個(gè)核細(xì)胞，以CD133(又稱AC133)，KDR雙陽(yáng)性細(xì)胞代表循環(huán)EPCs，流式檢測(cè)外周血EPCs數(shù)量；在添加50ng/mlVEGF及其它生長(zhǎng)因子的D

4、MEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；UEA-I結(jié)合和DiI-LDL攝取實(shí)驗(yàn)觀察EPCs是否具有內(nèi)皮細(xì)胞功能特性；CD133，KDR流式鑒定是否具有內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞表型；MTT法及改良Boyden小室測(cè)定培養(yǎng)EPCs的增殖及遷移能力。 2.冠狀動(dòng)脈病變程度評(píng)估：以Judkins法做選擇性冠狀動(dòng)脈造影，定量冠狀動(dòng)脈造影(QCAG)估價(jià)冠狀動(dòng)脈病變的血管和狹窄程度，根據(jù)Gensini等文獻(xiàn)中描述的方法計(jì)算冠狀動(dòng)脈病變Gensini評(píng)分。 3

5、.胰島素水平評(píng)估：電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定胰島素(Fins)，以穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)判斷胰島素抵抗程度。 結(jié)果: 1.循環(huán)EPCs培養(yǎng)、鑒定 1.1細(xì)胞培養(yǎng)第1天，相差顯微鏡下可見單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，胞體透亮，折光性好，散在分布于培養(yǎng)液中。4d可以觀察到細(xì)胞增多增大并伸展呈橢圓形、短梭形細(xì)胞，有少量細(xì)胞突起。培養(yǎng)7d，長(zhǎng)梭形細(xì)胞較前明顯增多，并呈簇狀生長(zhǎng)，有一定方向性，形成細(xì)胞克隆，LDL攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)

6、現(xiàn)中心圓形細(xì)胞熒光較弱，周邊梭形細(xì)胞熒光較強(qiáng)，提示中央圓形細(xì)胞可能為未分化或正在分化的干細(xì)胞，尚不具備內(nèi)皮功能，周邊梭形細(xì)胞則為已經(jīng)分化為具有部分內(nèi)皮功能的EPCs。14d可看到細(xì)胞首尾相連，長(zhǎng)寬比大于4，具有成索狀或網(wǎng)狀血管樣趨勢(shì)。培養(yǎng)21d，細(xì)胞相互融合呈鋪路石狀。 1.2培養(yǎng)7d細(xì)胞用DiI-acLDL和FTTC-UEA-I對(duì)細(xì)胞染色后[2]，通過(guò)共聚焦顯微鏡鑒定發(fā)現(xiàn)，綠色熒光細(xì)胞為FTTC-UEA-I結(jié)合陽(yáng)性，紅色熒光細(xì)

7、胞為acLDL-DiI攝取陽(yáng)性，黃色熒光細(xì)胞為UEA-I和DiLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞，被認(rèn)為是正在分化的EPCs，陰性對(duì)照未見染色。培養(yǎng)細(xì)胞雙染陽(yáng)性數(shù)為(85.34±6.07)％。 1.3培養(yǎng)7d細(xì)胞，CD133及KDR的陽(yáng)性率分別為(11.22±8.78)％、(52.6±12.24)％。 2.冠心病患者不同胰島素水平與循環(huán)EPCs數(shù)量及冠脈病變關(guān)系 2.1循環(huán)EPCs數(shù)量，CAD+IR組及CAD+IS組較對(duì)照組(

8、nCAD+IS組)均明顯減少，且CAD+IR組較CAD+IS組減少[(0.34.±0.08)‰vs.(0.47±0.09)‰)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01。 2.2CAD患者冠脈病變Gensini評(píng)分，CAD+IR組高于CAD+IS組(45.13±18.68vs.20.66±16.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 2.3CAD患者HOMA-IR、循環(huán)EPCs數(shù)量及Gensini評(píng)分與相關(guān)性分析，HOMA-

9、IR與循環(huán)：EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3785，P=0.009)，循環(huán)EPCs數(shù)量與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3984，P=0.006)。 3.冠心病患者不同胰島素水平對(duì)體外培養(yǎng)EPCs部分生物學(xué)功能影響 3.1MTT檢測(cè)體外培養(yǎng)的EPCs增殖能力，CAD+IR組及CAD+IS組均低于正常對(duì)照組(nCAD+IS組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；同時(shí)CAD+IR組低于CAD+IS組(0.27±0.0

10、9vs.0.39±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3.2改良Boyden小室檢測(cè)體外培養(yǎng)的EPCs遷移能力，CAD+IR組及CAD+IS組均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且CAD+IR組遷移低于CAD+IS組(16.9±4.5vs.25.6±5.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4.無(wú)冠心病患者不同胰島素水平對(duì)循環(huán)EPCs數(shù)量影響 對(duì)無(wú)冠心病組中，nCAD+IR組較nC

11、AD+IS組循環(huán)EPCs數(shù)量有減少趨勢(shì)[(0.51±0.09)‰vs.(0.58±0.07)‰)]，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＞0.05)。 結(jié)論: 1.冠心病患者較正常人循環(huán)EPCs數(shù)量較少，遷移、增殖能力下降，循環(huán)：EPCs數(shù)量及功能與冠脈病變程度呈負(fù)相關(guān)； 2.冠心病合并IR患者較IS者的循環(huán)EPCs數(shù)量減少，增殖、遷移功能損害，血清胰島素水平和循環(huán)EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)； 3.IR/HI可能通過(guò)或部分通