基于轉(zhuǎn)錄組測序枇杷EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)與利用.pdf

1、枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）起源于我國東南部，是中國特色水果，具有極高醫(yī)療保健價(jià)值，栽培歷史悠久，品種繁多，與其他國家相比我國枇杷種質(zhì)資源更為豐富。但目前對(duì)枇杷的遺傳研究及基因組信息研究較少，因此我們需要對(duì)枇杷進(jìn)行更深一步的分子基因組研究，為其種質(zhì)資源分類、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助選育等研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過對(duì)洞庭枇杷的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模測序，利用獲得的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，將開

2、發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行枇杷及其近緣物種間的通用性分析和遺傳多樣性分析，并對(duì)洞庭野生型和突變型枇杷進(jìn)行特異EST-SSR片段克隆進(jìn)而對(duì)其差異基因進(jìn)行探討，主要研究結(jié)果如下:
　　1.我們總共獲得61587個(gè)Unigene，對(duì)其進(jìn)行微衛(wèi)星搜索，得到6693個(gè)Unigene包含7649個(gè)SSR位點(diǎn)。在對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在二核苷酸到六核苷酸之間，重復(fù)類型最多的是二核苷酸其數(shù)量總計(jì)4593，占所有重復(fù)類型的60.05％;最少的重復(fù)類型

3、是五核苷酸，占總數(shù)的2.08％。在對(duì)重復(fù)類型最多的序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列中出現(xiàn)頻率最高的是二核苷酸重復(fù)類型中的AG/CT，占所有重復(fù)序列的52.6％;其次是三核苷酸重復(fù)類型中的AAG/CTT和AGG/CCT，分別占所有重復(fù)序列的6.6％和6％;而在二核苷酸重復(fù)序列類型中沒有出現(xiàn)CG/GC重復(fù)序列。
　　2.通過MISA搜索獲得到7649個(gè)SSR位點(diǎn)，成功設(shè)計(jì)出278對(duì)引物，我們用這278對(duì)引物在‘洞庭紅肉’和‘洞庭白肉’枇杷中

4、進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中246對(duì)引物都可以得到清晰明亮條帶，擴(kuò)增效率達(dá)到88.5％。
　　3.從278對(duì)EST-SSR引物中選擇擴(kuò)增效果好、條帶明亮和具有高多態(tài)性的25對(duì)引物分別對(duì)18份枇杷種質(zhì)、6份蘋果種質(zhì)以及3份桃種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這25對(duì)引物在這三種材料中擴(kuò)增效果都達(dá)到了92％，說明我們?cè)诙赐ヨ凌松祥_發(fā)的EST-SSR分子標(biāo)記在其他枇杷品種及其近緣物種上也具有一定通用性;并且我們發(fā)現(xiàn)Ej1、Ej46、Ej229這三對(duì)引物可

5、以用于區(qū)分這三大類試材。
　　4.在25對(duì)引物中其中22對(duì)都分別在三類材料上表現(xiàn)出了多態(tài)性，占88％。我們對(duì)22條EST-SSR引物在18份枇杷種質(zhì)上擴(kuò)增的條帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、多態(tài)信息含量、期望雜合度和觀察雜合度，發(fā)現(xiàn)所有遺傳參數(shù)的結(jié)果保持一致，其中Ej76引物的等位基因數(shù)為4.000、有效等位基因數(shù)為3.429、香農(nóng)指數(shù)為1.297、多態(tài)信息量為0.654、期望雜合度為0.729，表現(xiàn)出最

6、高的多態(tài)性;而Ej193、Ej229這兩對(duì)引物等位基因數(shù)為2.000、有效等位基因數(shù)為1.385、香農(nóng)指數(shù)為0.451、多態(tài)信息量為0.239、期望雜合度為0.286，表現(xiàn)出最低的多態(tài)性。通過建立0-1矩陣數(shù)據(jù)表計(jì)算出18份枇杷種質(zhì)的SM遺傳相似系數(shù)，根據(jù)相似系數(shù)進(jìn)行聚類，當(dāng)SM相似系數(shù)D1=0.666時(shí)，將18份枇杷種質(zhì)分為4大類，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。
　　5.我們將278對(duì)引物在野生型‘洞庭紅肉’枇杷和突變型‘洞庭白肉’枇

7、杷上進(jìn)行多次驗(yàn)證，Ej85和Ej94兩對(duì)引物因其在兩個(gè)材料上的差異表現(xiàn)出穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的特點(diǎn)而被我們選擇進(jìn)行差異EST-SSR片段克隆測序。
　　Ej85引物在兩種枇杷上擴(kuò)增的差異條帶大小為134bp，具體序列如下:TCCGTCTTCGTCGTCTTCTTTTATTTCTCTCTCTGTTCCGCCCTCCTCCTTTACACACACACACACCTCCCACCTCTCTGAACGATTGAAAGCAAAATTAATGGAGT

8、GGGATGGTAATTCGGATCTGGGCTTTG
　　Ej94在‘洞庭紅肉’枇杷擴(kuò)增的差異條帶大小為259bp，具體序列如下:ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGAGATTGACAAAGAAGGATGGAGCTTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGCCATTTGGCTTTAAGCTATCAAG

9、TATCAACCGTTCTTTTTGTCAACATAACTGTGTTCGGAATTTGCTTTTCTGCAAATTTTTATGGCCTTAGGGTTTTGATGGGATTAGAGTAAAGATACGGCCGTTTGG
　　Ej94在‘洞庭白肉’枇杷擴(kuò)增的差異條帶大小為221bp，具體序列如下:ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGA