污染湖泊宏基因組文庫(kù)中谷氨酸脫羧酶基因的克隆及功能研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)遞質(zhì)，具有多種保健功能。谷氨酸脫羧酶在催化谷氨酸脫去羧基后，可生成GABA。相對(duì)于化學(xué)合成法而言，利用微生物技術(shù)生產(chǎn)γ-氨基丁酸具有不可比擬的優(yōu)越性。未培養(yǎng)微生物中含有大量的新基因資源，而普通的分離純化以及純培養(yǎng)技術(shù)很難將其加以利用。因此，本課題探究了通過(guò)建立宏基因組文庫(kù)的辦法，挖掘自然界中新的谷氨酸脫羧酶基因，這在國(guó)內(nèi)外谷氨酸脫羧酶的研究中鮮有報(bào)道。
　　本課題利用酸性污染的環(huán)境樣品構(gòu)

2、建了以pGEM-3Zf(+)為載體，Escherichia coli DH5α為宿主的宏基因組文庫(kù)，其中總共包含1.2萬(wàn)個(gè)陽(yáng)性克隆，容量約為50.4 Mb。通過(guò)隨機(jī)測(cè)序并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一致性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該文庫(kù)中包含大量與參考序列一致性較低的新基因，證明了這一方法的有效性。
　　通過(guò)活性篩選策略，最終從文庫(kù)中篩選得到了兩個(gè)具有明顯變色反應(yīng)的陽(yáng)性克隆，命名為pGEMW1和pGEMW2。將這兩個(gè)陽(yáng)性克隆中所包含的ORF與Gen

3、Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一致性比對(duì)和功能鑒定，最終獲得了一個(gè)編碼谷氨酸脫羧酶的新基因，將其命名為gad3。該基因全長(zhǎng)約1.4 kb，編碼一條由469個(gè)氨基酸組成，分子量約為53 kDa，理論等電點(diǎn)為5.61的多肽鏈。在氨基酸水平上，它與Lactobacillus plantarum屬編碼的谷氨酸脫羧酶具有99％的一致性，但該基因來(lái)自于全基因組注釋，并沒(méi)有進(jìn)行功能鑒定。
　　將gad3基因表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，

4、發(fā)現(xiàn)其最適溫度為37℃，最適pH值為4.7，Sr2+，Co2+，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mg2+和Zn2+對(duì)酶促反應(yīng)有明顯的激活作用，Al3+、Fe3+、Mn2+和Cu2+對(duì)酶促反應(yīng)有明顯的抑制作用。EDTA對(duì)酶活有明顯的抑制作用，說(shuō)明該酶對(duì)金屬離子具有依賴性。純酶的Km值為0.619 mg/mL，kcat/Km=19.483 mL/(mg·s)。與其他來(lái)源的谷氨酸脫羧酶相比較，該酶的性質(zhì)參數(shù)處于中等水平。
　　本研究建立了一整套利用