磷酸化FoxO1在高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，超過(guò)30％的終末期腎功能衰竭是由糖尿病所致。糖尿病腎病在病理學(xué)上主要表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)分泌、腎小球硬化、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、腎小管間質(zhì)纖維化和足細(xì)胞凋亡等，其發(fā)病機(jī)制涉及到許多方面，包括高血糖、高血流灌注、炎癥因子、免疫損傷、氧化應(yīng)激和血脂異常等。有學(xué)者認(rèn)為腎臟固有細(xì)胞脂質(zhì)合成的增多導(dǎo)致腎臟內(nèi)脂質(zhì)積聚在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)

2、展中發(fā)揮著重要作用。本研究室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)高糖刺激人腎小管上皮細(xì)胞，可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)脂代謝相關(guān)蛋白ADRP和FAS的表達(dá)介導(dǎo)糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚，而應(yīng)用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002阻斷Akt激活后，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成明顯減少，提示PI3K/Akt通路參與了糖尿病腎小管上皮細(xì)胞的脂質(zhì)沉積，然而PI3K/Akt通路調(diào)控糖尿病腎臟脂質(zhì)沉積的具體機(jī)制尚未完全闡明。PI3K/Akt通路下游有許多目標(biāo)基因，包括Bad

3、、FoxO1、mTOR、PRAS40和GSK-3β，其中叉頭框蛋白1(forkhead transcription factors of O class1，F(xiàn)oxO1)廣泛分布于機(jī)體的各類(lèi)組織和細(xì)胞中，其上游主要受PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控，活化的Akt可使FoxO1發(fā)生磷酸化由核內(nèi)輸出至胞漿而失去轉(zhuǎn)錄活性。有關(guān)FoxO1在糖尿病中的研究揭示高糖可刺激腎臟固有細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路激活，活化的Akt使FoxO1磷酸化，核內(nèi)Fox

4、O1減少。PI3K/Akt激酶抑制劑LY294002刺激細(xì)胞時(shí)FoxO1的亞細(xì)胞定位主要位于核內(nèi)，F(xiàn)oxO1總蛋白水平?jīng)]有顯著的變化，磷酸化水平降低。提示FoxO1作為PI3K/Akt通路的下游因子參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展。但是目前有關(guān)FoxO1與糖尿病腎臟脂質(zhì)沉積的關(guān)系鮮有報(bào)道。
　　脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是體內(nèi)脂肪合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰CoA合成內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸。脂

5、肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）是一種主要的脂滴蛋白，位于多種細(xì)胞脂滴表面，是脂滴的主要成分之一，在脂滴很小時(shí)可檢測(cè)出ADRP的表達(dá)。油紅O染色是公認(rèn)的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的方法，靈敏度較高。本實(shí)驗(yàn)以FAS和ADRP表達(dá)量的變化及油紅O紅染脂滴顆粒作為檢測(cè)脂質(zhì)代謝的變化。
　　本研究通過(guò)高糖刺激體外培養(yǎng)的人腎小管細(xì)胞并轉(zhuǎn)染野生型FoxO1質(zhì)粒及Ser256位點(diǎn)發(fā)生

6、突變的FoxO1質(zhì)粒，觀察FoxO1、p-FoxO1、ADRP蛋白表達(dá)量和FAS mRNA變化，初步探討p-FoxO1與糖尿病腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系。
　　方法:人腎小管上皮細(xì)胞(HK2)在37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用含10％的胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。①采用CaCl2法制備DH5a感受態(tài)細(xì)胞，F(xiàn)oxO1野生型重組質(zhì)粒及256位點(diǎn)突變的FoxO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，搖菌擴(kuò)增后

7、提取質(zhì)粒。②細(xì)胞同步化后隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖組(25mmol/L葡萄糖)。高糖刺激48小時(shí)后終止培養(yǎng)，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)、RNA提取及油紅O染色，Western blot檢測(cè)FoxO1、p-FoxO1(Ser256)及ADRP蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FAS mRNA的表達(dá);油紅O觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化。③野生型及突變型FoxO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞隨機(jī)分為4組:空白細(xì)胞對(duì)照組、pcDN

8、A3.1空質(zhì)粒對(duì)照組、pcDNA3.1-wt FoxO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-mutation FoxO1(S256A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染后高糖刺激48小時(shí)，采用Western blot檢測(cè)FoxO1、p-FoxO1(Ser256)及ADRP蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FAS mRNA的表達(dá);油紅O觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化。
　　結(jié)果:
　　1.高糖對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞FoxO1、p-

9、FoxO1、ADRP和FAS表達(dá)的影響
　　Western blot檢測(cè)顯示正常對(duì)照組和高糖組HK2細(xì)胞總FoxO1表達(dá)未見(jiàn)明顯差異，定量分析條帶積分光密度比值分別為0.64±0.10和0.69±0.06;磷酸化FoxO1（即失活狀態(tài)的FoxO1）在兩組間表達(dá)不同，高糖組明顯高于正常對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量分別為0.43±0.04和0.23±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ADRP表達(dá)高糖組明顯高于正常對(duì)照組，分別為0.66

10、±0.22和1.19±0.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)FAS mRNA表達(dá)的檢測(cè)，高糖組表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，是正常對(duì)照組的2.73倍。
　　2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉(zhuǎn)染對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響
　　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉(zhuǎn)染48小時(shí)后總FoxO1蛋白明顯上調(diào)，分別是空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組的1.69倍和1.67倍;重

11、組質(zhì)粒pcDNA3.1-wt FoxO1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在高糖刺激下，p-FoxO1蛋白出現(xiàn)明顯上調(diào)，經(jīng)內(nèi)參校對(duì)條帶的積分光密度比為0.77±0.09，分別是空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組的1.91倍和2.00倍;高糖刺激下，pcDNA3.1-wt FoxO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組ADRP表達(dá)量也明顯升高,分別是空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組的1.56倍和1.57倍。Real-time PCR檢測(cè)FAS mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在pcDNA3.1-wt FoxO1重組質(zhì)粒

12、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，F(xiàn)AS mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高。采用油紅O染色方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，pcDNA3.1-wt FoxO1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較空白對(duì)照組出現(xiàn)更為清晰的紅染脂滴顆粒。
　　3.pcDNA3.1-mutation FoxO1(S256A)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)和影響
　　Western blot檢測(cè)顯示pcDNA3.1-mutation FoxO1(S256A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后總FoxO1蛋白較

13、空白對(duì)照組明顯升高，定量分析為1.05±0.31;p-FoxO1蛋白定量分析為0.34±0.03，與空白對(duì)照組相比減少17.4％;ADRP表達(dá)量也明顯降低，條帶積分光密度比值為0.73±0.14，與空白對(duì)照組相比降低31.8％。Real-time PCR結(jié)果顯示pcDNA3.1-mutation FoxO1(S256A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞FAS mRNA表達(dá)下降，較空白對(duì)照組減少了36.5％。油紅O染色方法顯示pcDNA3.1-mutati

14、on FoxO1(S256A)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴顆粒與空白對(duì)照組相比數(shù)量減少。
　　結(jié)論:
　　1.高糖刺激下人腎小管上皮細(xì)胞磷酸化FoxO1蛋白表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)ASmRNA和ADRP蛋白表達(dá)增加并引起細(xì)胞內(nèi)脂滴形成增多，提示磷酸化FoxO1可能參與了糖尿病腎小管上皮細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。
　　2.pcDNA3.1-wt FoxO1重組質(zhì)粒在高糖刺激下能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞p-FoxO1表達(dá)，上調(diào)脂肪酸合成