小麥與條銹菌親和互作的抑制性差減雜交文庫構(gòu)建及ESTs分析.pdf

1、由條形柄銹菌(Puccinia striiformis f. sp.tritici)引起的小麥條銹病，是影響我國小麥生產(chǎn)的重要病害之一。在病害流行年份，它可導(dǎo)致大規(guī)模的糧食減產(chǎn)，嚴(yán)重威脅著我國的糧食生產(chǎn)。目前，隨著ESTs相關(guān)技術(shù)的發(fā)展與完善，從分子水平上分離小麥與條銹菌互作過程中的差異表達基因，已成為揭示小麥條銹病發(fā)病機理的重要手段。 本實驗以小麥品種水源11和條銹菌CY31為材料，構(gòu)建了小麥經(jīng)條銹菌誘導(dǎo)36、72、120小時

2、的親和SSH-cDNA文庫。在差減文庫構(gòu)建過程中，高效的RNA提取方法成為有效利用SSH技術(shù)的基礎(chǔ)。本研究采用Biozol試劑和QIAGEN試劑盒提取了小麥幼苗葉片的總RNA。比較發(fā)現(xiàn)這兩種方法提取的小麥葉片總RNA均純度高、完整性好，但Biozol試劑提取總RNA的產(chǎn)率是QIAGEN試劑盒的1.47倍，這對于那些需求RNA量比較大的實驗，如構(gòu)建小麥葉片的抑制性差減雜交文庫、Northern雜交等，Biozol試劑就能充分展現(xiàn)出其明顯的

3、優(yōu)點。 文庫中的1 983個陽性克隆提取質(zhì)粒后測序，共得到1 707條高質(zhì)量的ESTs。Cap3軟件聚類后共獲得787個Unigenes，包括332個Contigs和455個Singlets。功能注釋和分類后，未知功能蛋白和Blastx比對后沒有顯著匹配的序列(nohits)占50.4％，為第一大類；與初級代謝和能量相關(guān)的基因分別占9.3％和6.5％，為第二大類；其次為與轉(zhuǎn)運、植物抗病及感病、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，分別占4.6％、

4、4.2％、4.1％；參與蛋白修飾、加工及蛋白合成、次生代謝、轉(zhuǎn)錄的基因分別占3.8％、3.2％、3.3％和2.9％；只有3個Unigenes與病原菌同源。 對文庫中的表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)小麥與條銹菌的親和反應(yīng)中同樣存在所謂的抗脅迫基因，如過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白、苯丙氨酸氨解酶、鋅指蛋白等。將本實驗結(jié)果與水源11和條銹病菌CY23的非親合SSH-cDNA文庫進行比較，發(fā)現(xiàn)本文庫中33.6％的unigenes未獲得同源性匹配，遠高于非