肝素對(duì)腸道菌及腸道菌群的作用與機(jī)制.pdf

1、肝素(heparin)和硫酸乙酰肝素（heparansulfate，HS）是一類由糖醛酸和氨基己糖組成的線性聚陰離子糖胺聚糖類(glycosaminoglycans，GAGs)大分子。除肝素和HS外，糖胺聚糖還包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等，而其中肝素和HS是糖胺聚糖中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的成員。在體內(nèi)，肝素主要由肥大細(xì)胞合成和貯藏，而HS則主要作為硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan，H

2、SPG)的組成部分，廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞表面和組織基質(zhì)中。肝素或HS的糖鏈結(jié)構(gòu)與長(zhǎng)度均有所不同，其二糖單元亦可進(jìn)行不同程度的N-或O-硫酸化，因此肝素和HS常表達(dá)為多樣化的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的多樣化賦予這類分子特異性或非特異性地結(jié)合多種宿主或外源蛋白質(zhì)的能力，從而在生物體內(nèi)表現(xiàn)出多樣的生物功能。
　　 肝素和HS參與體內(nèi)的多種生物過程，包括抗凝血、抗感染、炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞黏附和細(xì)胞分化等。越來越多的不同種類的傳染性微生物對(duì)

3、宿主的黏附、胞內(nèi)化或在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移被證實(shí)可以被肝素或HS降低。腸道條件致病菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等對(duì)腸道細(xì)胞或黏液層的黏附等已報(bào)道可被肝素降低。而肝素對(duì)腸道致病菌沙門菌、志賀菌等對(duì)腸道上皮細(xì)胞或黏液層的黏附的影響尚未見有報(bào)道。因此，本課題針對(duì)腸道致病菌，以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌和志賀菌為模型菌，對(duì)肝素抗腸道感染做一綜合研究，以期為肝素在抗腸道感染方面的新藥開發(fā)提供依據(jù)。與肝素對(duì)致病菌黏附影響的大量報(bào)

4、道不同，肝素對(duì)益生菌定殖的影響的研究極少報(bào)道。肝素對(duì)益生菌黏附腸道上皮細(xì)胞和黏液層的影響尚需進(jìn)一步研究。本課題以廣泛使用的鼠李糖乳桿菌LGG(LactobacillusrhamnosusGG)為研究對(duì)象，探討肝素對(duì)其黏附的影響和可能的機(jī)制。
　　 以往肝素的抗炎作用的研究，注意力集中在肝素與人體細(xì)胞的相互作用上，且用藥途徑多為注射。肝素對(duì)腸道菌群的影響尚未有報(bào)道。針對(duì)腸道炎癥或腸道感染，口服肝素可能具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且肝素可能通

5、過影響腸道菌群進(jìn)而發(fā)揮作用。因此，本課題以大鼠為動(dòng)物模型，研究了肝素對(duì)腸道菌群的影響，并提出肝素可作為一種有效腸道菌群調(diào)節(jié)物質(zhì)，起到益生元的作用。
　　 1、肝素對(duì)幾株腸道致病菌和益生菌黏附作用的影響的體外研究
　　 目的：考察體外肝素對(duì)常見腸道致病菌和益生菌黏附及定殖的影響。
　　 方法：分別以HT-29單層細(xì)胞培養(yǎng)為腸道上皮細(xì)胞模型，固定化黏液素為黏液層模型，考察肝素對(duì)腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、金黃色葡

6、萄球菌、沙門菌和志賀菌等常見腸道致病菌以及益生菌鼠李糖乳酸桿菌LGG黏附腸道上皮細(xì)胞和黏液層的影響。同時(shí)，通過LGG和EPEC黏附腸道上皮細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)、取代和抵御實(shí)驗(yàn)，探討肝素與LGG有無協(xié)同作用及肝素抗感染的可能機(jī)制。此外，通過肝素對(duì)LGG生物膜形成能力的考察，進(jìn)一步評(píng)價(jià)肝素對(duì)益生菌定殖的影響。
　　 結(jié)果：肝素可抑制EPEC對(duì)HT-29細(xì)胞和黏液層的黏附，其中對(duì)EPEC黏附HT-29細(xì)胞的抑制作用表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。當(dāng)濃度≥50μ

7、g/mL時(shí)，肝素即可達(dá)到顯著抑制效果。肝素對(duì)腸道致病菌黏附HT-29細(xì)胞的抑制作用有一定選擇性，除EPEC外，還可以抑制金黃色葡萄球菌的黏附，但對(duì)沙門菌和志賀菌則無明顯作用。此外，肝素對(duì)益生菌LGG的HT-29細(xì)胞和黏液層黏附均無顯著影響。在競(jìng)爭(zhēng)和抵御實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)LGG濃度較低時(shí)，LGG與肝素聯(lián)合應(yīng)用可顯著增強(qiáng)對(duì)EPEC黏附HT-29細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)和抵御作用;而LGG濃度較高時(shí)，肝素的效果相對(duì)不明顯。肝素對(duì)LGG取代黏附EPEC無明顯作用。在

8、LGG生物膜形成實(shí)驗(yàn)中，肝素可顯著增強(qiáng)LGG的生物膜形成，生物膜生成量提高約30％。
　　 結(jié)論：肝素具有選擇抑制病原菌黏附HT-29細(xì)胞和黏液層的能力，其作用機(jī)制主要是外源肝素競(jìng)爭(zhēng)或封閉細(xì)菌黏附結(jié)構(gòu)。這種選擇性抑制黏附的能力賦予肝素在防止腸道細(xì)菌感染和輔助治療腸道感染方面潛在應(yīng)用價(jià)值。另外，由于肝素?cái)y帶大量負(fù)電荷，可以促進(jìn)LGG形成生物膜從而利于益生菌定殖，我們提出肝素作為益生因子，與LGG協(xié)同使用，發(fā)揮更好的效果。
　

9、　 2、肝素對(duì)腸道菌群的影響的體內(nèi)研究
　　 目的：考察口服肝素及heparosan（未硫酸化的肝素前體）對(duì)大鼠腸道菌群及其主要組成細(xì)菌類群的影響及可能機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組，即生理鹽水組，肝素-低劑量組、肝素-高劑量組、heparosan-低劑量組和heparosan-高劑量組。每組均以灌胃方式給藥，其中低劑量組按照5mg/kg體重，高劑量組按照10mg/kg體重，分別給予肝素或heparosan;

10、生理鹽水組灌胃等體積生理鹽水。每日上午給藥，持續(xù)進(jìn)行14d。收集第14日糞便提取總DNA后，采用16SrRNAV3可變區(qū)通用引物或乳桿菌、擬桿菌及梭菌特異性引物PCR擴(kuò)增16SrRNA。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）和主成分分析。差異條帶切膠回收并克隆測(cè)序。
　　 結(jié)果:肝素和heparosan可顯著改變大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成。與生理鹽

11、水組相比，肝素組或heparosan組乳桿菌的比例顯著提高，而糞腸球菌比例下降。進(jìn)一步的菌屬特異性16SrRNAPCR-DGGE及測(cè)序結(jié)果顯示，糞便中乳桿菌組成較為簡(jiǎn)單，肝素或heparosan組的L.taiwanensis和L.gallinarum組成增加。肝素或heparosan也會(huì)導(dǎo)致糞便的擬桿菌組成發(fā)生變化，但這種變化與腸道菌群病理變化的關(guān)系尚不清楚。此外，口服肝素或heparosan均未觀測(cè)到直腸出血等不良作用。
　　

12、 結(jié)論:肝素和heparosan可選擇增殖腸道內(nèi)乳桿菌，使L.taiwanensis和L.gallinarum等乳桿菌相對(duì)比例提高，而乳桿菌等益生菌增多有利于維持穩(wěn)定、健康的腸道菌群平衡。因肝素和heparosan對(duì)腸道菌群表現(xiàn)出類似的調(diào)節(jié)效果，我們推測(cè)肝素或heparosan的調(diào)節(jié)機(jī)制主要是由于其多糖骨架。經(jīng)肝素或heparosan調(diào)節(jié)的腸道菌群，對(duì)腸道致病菌的抵抗能力有所增強(qiáng)。因heparosan可經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵獲得，同時(shí)沒有抗凝血等功