大豆對低氮脅迫的形態(tài)和生理學(xué)響應(yīng)及介導(dǎo)低氮脅迫miRNA的鑒定.pdf

1、大豆(Glycine max(L.)Merr.)作為固氮作物，雖然能夠通過生物固氮獲得一部分氮素，但由于大豆籽粒蛋白含量高，對氮素需求量高，增施氮肥仍然是大豆增產(chǎn)的必要措施。不過氮肥利用效率低，增施氮肥不僅增加生產(chǎn)成本，而且易對環(huán)境造成危害。因此，篩選和培育耐低氮大豆品種就顯得非常必要，而這有賴于大豆耐低氮脅迫的生理學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)理的闡明。
　　miRNA作為一類內(nèi)源性的、21-24個(gè)堿基組成的非編碼單鏈小分子RNA，在植物生長

2、發(fā)育和環(huán)境脅迫應(yīng)答等過程中中均發(fā)揮著重要的作用，且有證據(jù)表明，miRNA也參與營養(yǎng)脅迫響應(yīng)。因而，篩選重要的低氮脅迫響應(yīng)的miRNA及其靶基因就具有重要的研究意義。
　　本研究以前期篩選出的耐低氮脅迫的大豆品種“116”和低氮脅迫敏感的大豆品種“84-70”為試驗(yàn)材料，通過溶液培養(yǎng)試驗(yàn)研究低氮脅迫對不同基因型大豆根系形態(tài)和氮代謝相關(guān)指標(biāo)的影響，同時(shí)也分析不同基因型大豆的葉片光合作用特性、碳水化合物積累對低氮脅迫響應(yīng)的差異，從而探討

3、耐性品種對低氮脅迫的形態(tài)和生理耐性機(jī)制;接著利用Solexa深度測序與生物信息學(xué)手段，篩選和鑒定與低氮脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNA，旨在揭示大豆苗期耐低氮脅迫的分子機(jī)制。研究工作獲得了以下主要結(jié)果:
　　1.根系是作物吸收氮素的主要器官，在低氮脅迫下，兩個(gè)大豆品種的根長、表面積和體積均明顯降低，但耐低氮品種的大豆品種“116”的降幅要少于低氮脅迫敏感的大豆品種“84-70”，另外無論是低氮脅迫還是正常供氮水平，大豆品種“116”的根長

4、、表面積和體積均大于大豆品種“84-70”;根的平均直徑在低氮脅迫下的反應(yīng)與比根長、表面積和體積的反應(yīng)相反，它們在低氮脅迫下有所增大，并且大豆品種“116”增加幅度要稍大于大豆品種“84-70”。
　　2.就氮的吸收效率而言，兩個(gè)大豆品種在低氮脅迫下存在差異，表現(xiàn)在大豆品種“84-70”在低氮脅迫下葉和根中的總氮含量和硝態(tài)氮含量與正常氮處理下相比降幅較大，而大豆品種“116”則降幅較少;而且大豆品種“116”還表現(xiàn)更強(qiáng)的氮素同化能

5、力，因?yàn)樗陌被岷涂扇苄缘鞍缀吭诘偷{迫下降低的幅度比大豆品種“84-70”少，這與NR活性反應(yīng)一致，NR活性在大豆品種“116”根和葉中下降的幅度分別為1.7％～12.5％和1.5％～14.4％，而在大豆品種“84-70”根和葉中下降的幅度分別為3.2％～20.2％和3.8％～30.7％。另外，低氮脅迫下GS活性在兩個(gè)品種中下降的幅度接近，不能解釋兩個(gè)大豆品種在低氮脅迫下氮素同化能力的差異。
　　3.與大豆品種“84-70”

6、相比，大豆品種“116”光合作用受到低氮脅迫的影響要少的多。在整個(gè)低氮脅迫處理時(shí)期，大豆品種“84-70”光合速率下降幅度為2.4％～31.5％，而在大豆品種“116”光合速率下降幅度為0.9％～14.6％。而就影響光合作用的非氣孔因素和氣孔因素而言，在低氮脅迫下，耐性品種的葉綠素a、b及a+b總含量與正常氮處理相比下降幅度較少，葉綠素a/b的比值較對照提高明顯，而不耐品種的葉綠素a及a+b總量較對照降低幅度明顯增大，葉綠素a/b的比值

7、較對照提高比例較少;兩個(gè)大豆品種的氣孔導(dǎo)度和葉片胞間CO2也受低氮脅迫影響，與葉綠素含量受影響類似，不耐低氮大豆品種“84-70”下降的幅度比耐低氮品種“116”大。另外，低氮脅迫下大豆品種“116”的蒸騰速率和水分利用效率相對正常氮處理變化幅度分別為0.03～0.47mmolH2O.m-2s-1和0.01～0.28μmol CO2/mmolH2O，而大豆品種“84-70”蒸騰速率和水分利用效率變化幅度0.05～0.92mmol H2O

8、.m-2 s-1和0.04～0.63μ mol CO2/mmolH2O。
　　4.氮代謝與碳代謝密切相關(guān)，低氮脅迫處理能增加兩個(gè)大豆品種的葉和根的可溶性糖含量，但增加的幅度有所差別，在葉中，大豆品種“116”的可溶性糖含量增加的幅度少于大豆品種“84-70”，但是在根中，耐低氮品種“116”的可溶性糖含量增加的幅度大于不耐低氮品種“84-70”，表明大豆品種“116”可將更多的可溶性糖轉(zhuǎn)運(yùn)到植株的根部來滿足根系的正常生長，從而有利

9、于從低氮環(huán)境中吸收更多的氮元素;低氮脅迫處理也能影響兩個(gè)大豆品種的葉和根的淀粉含量，大豆品種“84-70”的淀粉含量在低氮脅迫下增加的幅度為0.20mg/g～3.32mg/g，而大豆品種“116”中增加的幅度為0.12mg/g～0.94mg/g，顯然，大豆品種“84-70”的淀粉含量增加的幅度高于大豆品種“116”。
　　5.利用Solexa/Illumina高通量測序，在構(gòu)建的16個(gè)小RNA文庫中獲得了348，651，354條T

10、otal clean reads和52，351，387條unique reads，經(jīng)生物信息學(xué)分析，鑒定了362條已知大豆miRNAs或miRNAs變體，分屬158個(gè)miRNA家族，同時(shí)還獲得了歸屬于55個(gè)miRNA家族的90條新大豆miRNAs。需指出的是，雖絕大部分新大豆miRNAs位于基因組上的編碼基因間隔區(qū)，但也有小部分新miRNA位點(diǎn)位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子或外顯子區(qū)域。
　　6.通過分析miRNA在低氮脅迫處理文庫與其

11、相應(yīng)對照氮濃度處理文庫中的差異表達(dá)，共鑒定了150個(gè)已知的miRNAs和2個(gè)新miRNAs參與大豆對短期和長期低氮脅迫的響應(yīng)，其中在大豆品種“116”根和葉中，分別有14條和54條miRNA參與短期低氮脅迫的響應(yīng)，分別有37條(含1條新miRNA)和28條miRNA參與長期低氮脅迫的響應(yīng);而在大豆品種“84-70”的根和葉中，分別有13條和57條miRNA(含1條新miRNA)參與短期低氮脅迫的響應(yīng)，分別有34條和33條miRNA參與長

12、期低氮脅迫的響應(yīng)。這些miRNA有的可同時(shí)參與兩個(gè)品種或兩個(gè)時(shí)間段處理的低氮脅迫響應(yīng)，并把這些低氮脅迫響應(yīng)miRNA歸為四類。
　　7.差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測結(jié)果表明，在兩個(gè)大豆品種的根中，68個(gè)低氮脅迫響應(yīng)的已知miRNA中的53個(gè)和1個(gè)新miRNA能夠預(yù)測到靶基因，靶基因總數(shù)分別為223個(gè)和14個(gè)，其余的miRNA未能預(yù)測到相關(guān)的靶基因;而在兩個(gè)大豆品系的葉中，124個(gè)低氮脅迫響應(yīng)的已知miRNA中的93個(gè)能夠預(yù)測到靶