尼古丁對大鼠中腦α-7型神經(jīng)煙堿膽堿能受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的吸煙可以致癌，孕婦主動(dòng)或被動(dòng)吸煙會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良及后代中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，如認(rèn)知障礙、注意力渙散、學(xué)習(xí)和記憶能力低下、低智商以及行為異常等。在世界各國，每年因吸煙引起的死亡人數(shù)占全部死亡人數(shù)的20％，吸煙所致死亡占死因分析的首位。煙草已成為人類一大公害。盡管人們都知道吸煙有很多危害，然而人們還是持續(xù)吸食難以戒掉，這是由于煙草中含有尼古丁，尼古丁是導(dǎo)致吸煙成癮的主要生物堿。學(xué)者們一直在探索尼古丁致癮機(jī)制，試圖搞清致癮通路，尋

2、找切入點(diǎn)，為戒煙提供有效的方法。目前認(rèn)為，尼古丁主要通過中腦皮質(zhì)邊緣和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能通路產(chǎn)生成癮作用。在中腦皮質(zhì)邊緣系統(tǒng)中，神經(jīng)元胞體位于腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，尼古丁通過對胞體上神經(jīng)煙堿膽堿能受體的作用，使下游伏隔核的多巴胺釋放增加，從而使人感到愉快并為之形成癖好。這種愉快感和癖好的形成驅(qū)動(dòng)了成癮過程，其機(jī)制對毒品濫用和犒賞行為的加強(qiáng)都起到了重要的作用。此外，在黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能通路中，神經(jīng)元胞體位于黑質(zhì)區(qū)(SN)，尼古丁能增加

3、多巴胺在紋狀體尾狀核和豆?fàn)詈藚^(qū)域的釋放。 在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)，尼古丁通過α-7型神經(jīng)煙堿膽堿能受體(α-7nAChRs)來發(fā)揮作用，該受體與尼古丁具有高親和性，尼古丁與之作用后，導(dǎo)致離子通道開放，受體構(gòu)型改變，使鈣離子內(nèi)流，從而改變神經(jīng)元的功能，所以α-7nAChRs被認(rèn)為是與尼古丁作用的主要受體。迄今為止，尼古丁對大鼠中腦α-7nAChRs的調(diào)節(jié)機(jī)制還不能解釋清楚。本研究應(yīng)用原位雜交、免疫組織化學(xué)和western-blot技術(shù)，從

4、模型鼠腦和模式細(xì)胞入手，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平研究尼古丁對大鼠中腦α-7nAChRs蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)及分布的影響，進(jìn)一步探索尼古丁致癮作用的機(jī)理。 方法1.建立大鼠急性暴露尼古丁的動(dòng)物模型。將大鼠隨機(jī)分成二個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組每日8：30分別皮下注射尼古丁0.4mg/kg.d，30.0mg/kg.d，每天一次，連續(xù)七天；對照組在同一時(shí)間皮下注射同等體積的生理鹽水。最后一次注射后12小時(shí)進(jìn)行心臟灌流，獲取固定的腦

5、組織。 2.尼氏染色定位各腦區(qū)。 3.免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠腦α-7nAChRs表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4.原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測大鼠腦α-7nAChRmRNA的表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 5.PC12細(xì)胞傳代培養(yǎng)。PC12細(xì)胞接種于RIPM1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入NGF(50ng/ml)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化。 6.Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測尼古丁對PC12細(xì)胞α-7nAChRs的影響

6、。NGF誘導(dǎo)和無NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞各分為四組，設(shè)為對照組，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(10μM尼古丁24h；100μM尼古丁24h；100μM尼古丁48h)。 結(jié)果一.建立了大鼠急性暴露尼古丁的動(dòng)物模型Wistar雄性大鼠，體重180-200克，對照組與2個(gè)實(shí)驗(yàn)組各10只，分籠單獨(dú)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠注射尼古丁后狀態(tài)良好，2只高劑量組的大鼠分別在第二天和第五天死亡。 二.尼氏染色定位大鼠各腦區(qū) 三.免疫組織化學(xué)染色及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)

7、果在實(shí)驗(yàn)組大腦皮質(zhì)內(nèi)，神經(jīng)細(xì)胞的α-7nAChRs染色強(qiáng)度高于對照組，α-7nAChRs表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組和對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，VTA和SN區(qū)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 四.原位雜交法染色及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)組VTA和SN區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞α-7nAChRs染色強(qiáng)度高于對照組，α-7nAChRmRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組和對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，大腦皮質(zhì)區(qū)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

8、五.PC12細(xì)胞熒光抗體法染色結(jié)果未經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞，胞體小而圓，胞質(zhì)染成桔紅色；經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)樣改變，胞體增大，伸出許多突起，突起末端形成生長錐，突起間形成突觸連接。 六.Western-blot檢測結(jié)果未經(jīng)NGF誘導(dǎo)組α-7nAChRs蛋白表達(dá)結(jié)果是，100μM尼古丁48h組＞100μM尼古丁24h組＞10μM尼古丁24h組＞對照組。NGF誘導(dǎo)組α-7nAChRs蛋白表達(dá)結(jié)果是，100μM尼古丁