Ang2 mRNA在急性髓系白血病患者骨髓細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、背景與目的:
　　 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種生物學(xué)和預(yù)后相差顯著的嚴(yán)重危害人類健康的常見造血系統(tǒng)惡性腫瘤?；熞恢笔茿ML傳統(tǒng)的治療手段,目前60％～80％的AML患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化療后可以獲得完全緩解(completeremission,CR),但即使獲得CR后通過(guò)鞏固治療、定期強(qiáng)化和維持治療,無(wú)病生存率仍徘徊于40％-50％的低水平間,多數(shù)由于對(duì)抗白血病藥物產(chǎn)生多藥耐藥而使治療失

2、敗。AML具有復(fù)雜的異質(zhì)性,不同亞型AML的治療方法不同,預(yù)后也有很大差別?；颊叩哪挲g和遺傳學(xué)改變是初診AML的主要預(yù)后因素,大約55％的AML都存在細(xì)胞遺傳學(xué)的異常。此外高白細(xì)胞數(shù)、達(dá)緩解時(shí)間延遲、繼發(fā)白血病等被認(rèn)為是白血病的不良預(yù)后因素。通過(guò)SNP、基因芯片等技術(shù)已證實(shí),許多基因突變和基因表達(dá)異常與白血病的預(yù)后相關(guān),如具有CEBPA、NPM1基因突變的AML預(yù)后較好,而WT1突變、P53突變、MLL突變和FLT3-TKD突變的AML

3、預(yù)后則較差。伴有Sorcin、EGR、BAALC、MN1等基因高表達(dá)的白血病預(yù)后也較差。而MLL-PTD對(duì)AML后無(wú)影響。因而根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)診斷與預(yù)后分析,采取靶向治療和個(gè)體化治療相結(jié)合的手段,將進(jìn)一步提高白血病治療效果。
　　 文獻(xiàn)檢索及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),血管生成素2(angiopoietin2,Ang2)位于8p21,相對(duì)分子質(zhì)量約為75×103,全長(zhǎng)496個(gè)氨基酸,約60％與Ang1相同,分子結(jié)構(gòu)也與Ang1

4、類似,均包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。Ang2是一個(gè)內(nèi)皮特異性生長(zhǎng)因子,主要表達(dá)于血管重塑活躍的部位及血管高度增生的腫瘤組織,可能是腫瘤血管生成的早期信號(hào),其表達(dá)增多是腫瘤快速增長(zhǎng)并易于發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)早期標(biāo)志。Ang2基因在胃癌、乳腺癌、肝癌、血管瘤及膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高,并與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(Reverse transcripase polymerase chainreaction,RT-PCR)方法分析Ang2在CD7(

5、+)AML高表達(dá),而t(8；21)的AML低表達(dá),經(jīng)化療達(dá)完全緩解后Ang2水平表達(dá)降低,不易檢測(cè)到[1]。免疫組化法分析證實(shí)Ang2在AML患者骨髓中高表達(dá),且在慢性粒細(xì)胞白血病(Chronicmyeloid leukemia,CML)急變中Ang2表達(dá)高于慢性期患者[2]。Martinelli等[3]測(cè)定早期的B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)Ang2的表達(dá),結(jié)果顯示早期的B

6、細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病Ang2高表達(dá)與IgV(H)基因突變、骨髓血管增生相關(guān)。
　　 鑒于Ang2基因在實(shí)體瘤中的表達(dá)與作用,以及在白血病中的初步研究結(jié)果,本文通過(guò)實(shí)時(shí)熒光熒光定量PCR(Rreal-time quatitative PCR,RQ-PCR)技術(shù)檢測(cè)Ang2在AML中的表達(dá),旨在探索Ang2對(duì)AML的早期診斷、治療及預(yù)后的影響有無(wú)意義,在各類型中表達(dá)有無(wú)差異,能否作為治療的靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　

7、 1.研究對(duì)象:所有白血病骨髓標(biāo)本均取自臨床表現(xiàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫分型及細(xì)胞遺傳學(xué)特征確診的患者,初治組98例,復(fù)發(fā)組13例,難治組10例,緩解組18例,正常對(duì)照組為年齡、性別匹配的健康供者16例。
　　 2.引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GeneBank的序列設(shè)計(jì)Ang2各基因及管家基因β-actin引物。
　　 3.提取白血病及健康供者骨髓單個(gè)核細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過(guò)熔解曲線確定PC

8、R產(chǎn)物的特異性。取兩管平均Ct值計(jì)算2-△CT值,作為各標(biāo)本mRNA的相對(duì)表達(dá)量,△CT=(目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值)。比較AML初治組與正常對(duì)照組、初治組與緩解組、初治組與復(fù)發(fā)組、初治組與難治組、復(fù)發(fā)組與正常對(duì)照組、難治組與正常對(duì)照組、復(fù)發(fā)組與緩解組、難治組與緩解組、AML各亞型之間、各亞型與正常對(duì)照組之間Ang2mRNA表達(dá)水平有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以對(duì)照組表達(dá)水平中位數(shù)2倍為界,將研究對(duì)象分為高表達(dá)組與低表達(dá)組,比較初治組中首療程

9、CR組與NR(no completeremission)組、復(fù)發(fā)或進(jìn)展為難治性白血病發(fā)生率、正常核型與預(yù)后不良核型組、3年內(nèi)死亡病例組與3年內(nèi)仍存活病例組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ang2mRNA表達(dá)水平差異,及高表達(dá)組和低表達(dá)組無(wú)病生存期和總生存期的差異。
　　 4.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料呈非正態(tài)分布,用中位數(shù)描述；兩組計(jì)量資料間分布比較用Mann-Whitney U test；兩變量間相關(guān)分析采用Spearm

10、an rank correlation analysis；率的比較采用chi-square test；生存分析用Kaplan-Meier曲線:生存率比較用log-rank檢驗(yàn)；單因素分析及多因素分析用Cox Regression；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)論:
　　 1.所提取RNA、cDNA純度高、質(zhì)量好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.所設(shè)計(jì)的各基因引物特異性好、與管家基因擴(kuò)增效率一致。
　

11、　 3.Ang2 mRNA表達(dá)水平在AML初治組、復(fù)發(fā)組及難治組顯著高于正常對(duì)照組和緩解組。初治組和復(fù)發(fā)組、初治組和難治組比較均沒有顯著性差異。AML各亞型之間、各亞型和正常對(duì)照組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。M2亞型Ang2 mRNA表達(dá)水平顯著高于緩解組,其余各亞型與緩解組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.將各基因表達(dá)水平與患者初診時(shí)年齡、血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板、乳酸脫氫酶水平和外周血白血病細(xì)胞比例及骨髓白血病細(xì)胞比例等指標(biāo)做相關(guān)性

12、分析發(fā)現(xiàn),Ang2 mRNA 表達(dá)水平與患者初治時(shí)年齡、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、外周血原幼稚細(xì)胞比例、骨髓原幼稚細(xì)胞比例均無(wú)顯著性相關(guān),相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均小于0.3,P>0.05。
　　 5.正常核型組與預(yù)后不良核型組比較沒有顯著性差異,從側(cè)面提示Ang2有可能成為評(píng)估AML早期診斷的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。
　　 6.AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞高表達(dá)Ang2 mRNA首療程CR率低,難治性白血病發(fā)病率高。Ang2基因