結(jié)核分枝桿菌預(yù)苯酸脫氫酶的酶學(xué)研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)核分枝桿菌預(yù)苯酸脫氫酶的酶學(xué)研究姓名：徐勝鳳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：王洪海20070515摘要結(jié)核病已經(jīng)成為全球性的健康問題，其治病率和死亡率逐年增加。近年來，由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌的多耐菌株的出現(xiàn)，以及結(jié)核桿菌和H I V 病毒之間的協(xié)同作用，結(jié)核病的情況日益嚴(yán)竣。迫切需要新的抗結(jié)核藥物以縮短治療時(shí)間和應(yīng)對(duì)上述出現(xiàn)的問題。芳香族氨基酸的合成途徑不存在于哺乳動(dòng)物中，它們由食物中攝取這些必需氨基

2、酸。然而，對(duì)于藻類、細(xì)菌、真菌和高等植物，它們必需自行合成芳香族氨基酸。這種高度選擇性使得芳香族氨基酸合成途徑中的酶成為可能的開發(fā)有效抗結(jié)核藥物的藥靶。酪氨酸合成途徑是莽草酸途徑的一個(gè)分支。而預(yù)苯酸脫氫酶( P D H ) 則是酪氨酸合成途徑中的第二個(gè)酶，催化分支酸合成對(duì)羥苯丙酮酸，這一反應(yīng)過程中N A D + 是輔酶。本實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)苯酸脫氫酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。重組的結(jié)核桿菌預(yù)苯酸脫氫酶( H i s ．r M t P D H ) 在大

3、腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中進(jìn)行表達(dá)，通過親和純化獲得高純的重組蛋白，H P L C 和質(zhì)譜證明所得的確為重組目的蛋白。同時(shí)通過腸激酶得到切除其N 端H i s - t a g 的重組P D H 。通過測試p I - I ，溫度和N a + 陽離子對(duì)酶活反應(yīng)的影響確定了最優(yōu)的反應(yīng)條件。在此反應(yīng)條件下，獲得該酶對(duì)底物預(yù)苯酸和N A D + 的各項(xiàng)酶學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)N 端H i s - t a g 對(duì)酶活性的影響很小。另外